Патент на изобретение №2261907

(54) ШТАММ БИФИДОБАКТЕРИЙ Bifidobacterium longum B 379М-МБ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ КИСЛО-МОЛОЧНЫХ, НЕФЕРМЕНТИРОВАННЫХ ПРОДУКТОВ, БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК, БИФИДОСОДЕРЖАЩИХ ПРЕПАРАТОВ, КОСМЕТИЧЕСКИХ И ГИГИЕНИЧЕСКИХ СРЕДСТВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой и медицинской промышленности и может быть использовано в производстве продуктов функционального питания пробиотического назначения, гигиенических и косметических средств. Штамм Bifidobacterium longum В379М-МБ получен путем последовательных циклов лиофилизационной сушки и восстановления на питательной тиогликолевой среде (50 циклов сушка-восстановление). Отбирали клоны по признаку максимального накопления биомассы бифидобактерий в стерильном обезжиренном молоке к 16 ч культивирования не менее lg 9, а также с выраженной антиоксидантной активностью: супероксиддисмутазная активность штамма не ниже 25,9 ед/мг белка. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов “ВНИИГенетика” за номером ВКПМ Ас-1689. Штамм активно размножается в питательных средах с накоплением необходимого титра жизнеспособных бактерий, обладает высокой кислотообразующей способностью и антагонистическими свойствами в отношении патогенной и условно патогенной микрофлоры, проявляет выраженную антиоксидантную активность. Супероксиддисмутазная активность культуры свидетельствует о выраженном пробиотическом действии, проявляемом в условиях in vivo и in vitro. Использование штамма в производстве кисломолочных, неферментированных продуктов, биологически активных добавок, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств, обеспечивает пробиотический и бактериологический эффект, способствует восстановлению нормальной микрофлоры, кожных и слизистых покровов, а также направлено на расширение арсенала аналогичных средств. 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой промышленности и может быть использовано в производстве продуктов функционального питания, неферментированных продуктов, фармпрепаратов, при приготовлении косметических и гигиенических средств.

Широкий ассортимент биологически активных и технологичных штаммов бифидобактерий дает возможность разрабатывать новые моно и комплексные продукты функционального питания, лечебного питания и бакпрепараты, способные обеспечивать высокую колонизационную резистентность кишечника человека, восстанавливать его нормальную микрофлору, снижать заболеваемость различными кишечными инфекциями.

На настоящий момент разработан ряд бактерийных препаратов и продуктов лечебно-диетического питания на основе отечественных штаммов бифидобактерий Bifidobacterium longum B379M, B.longum Я-2, В.longum Я-4 (патент SU 849779, RU 2216588, RU 2216589).

Качество продуктов функционального питания и бакпрепаратов обусловлено свойствами штамма-продуцента, его специфической активностью и производственно-ценными свойствами.

Известный штамм Bifidobacterium longum B 379 M, используемый для получения жидкого концентрата бифидобактерий, кисломолочных, лечебно-диетических продуктов и биологически активных добавок, является наиболее близким аналогом к заявленному штамму. Штамм выделен из кишечника здорового грудного ребенка, депонирован в ЦМПМ “ВНИИГенетика” под номером В-2000. Штамм фермент каталазу не образует, желатину не разжижает, в аэробных условиях на плотных питательных средах не растет. Ферментирует арабинозу, ксилозу, лактозу, рибозу, слабо и непостоянно целлобиозу, не разлагает маннит, сорбит, инозит, салицин. Характерной особенностью штамма является его способность сквашивать молоко к 18-20 ч культивирования с образованием сгустка нежной консистенции. Штамм – энергичный кислотообразователь.

Кислотообразующая активность: к 24 ч – 100-110°Т, к 72 ч – 150-180°Т (на печеночной среде), на гидролизатно-молочной среде – до 120°Т и 240°Т соответственно.

Известный штамм недостаточно устойчив к повреждающим факторам агрессивных сред гастроинтестинального тракта (кислот, протеолитических ферментов) при прохождении бифидобактерий штамма в желудочно-кишечном тракте, что указывает на недостаточную его колонизирующую активность при прохождении пищеварительного тракта.

Задачей предлагаемого изобретения является выявление штамма Bifidobacterium longum В379М-МБ, обладающего высокой кислотообразующей способностью, устойчивостью к широкому спектру антибиотиков, выраженной антагонистической и антиоксидантной активностью, биологической активностью, высокой жизнеспособностью и колонизирующими свойствами, что обеспечивает получение продуктов функционального питания, продуктов на его основе и бактериальных препаратов с высокими пробиотическими и лечебно-профилактическими свойствами.

Штамм В.longum B379M-МБ получен из коллекционного штамма В.longum В379М путем последовательных циклов лиофилизационной сушки и восстановления на питательной тиогликолевой среде (50 циклов сушка-восстановление). Отбирали клоны по признаку максимального накопления биомассы бифидобактерий в стерильном обезжиренном молоке к 16 ч культивирования не менее lg 9, а также с выраженной антибиотической и антиоксидантной активностью: супероксиддисмутазная активность штамма не ниже 25,9 ед/мг белка.

В результате проведенной селекции получен штамм В.longum В379М-МБ, который депонирован и хранится во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов “ВНИИГенетика” за номером ВКПМ Ас-1689 и характеризуется следующими признаками:

Культурально-морфологические признаки.

Клетки представляют собой грамположительные полиморфные палочки с бифурикацией или утолщением на 1-2 концах, склонные к образованию скоплений. В печеночной среде Блаурокка образует колонии в виде комет.

Физиолого-биохимические признаки.

Облигатный анаэроб, оптимальная температура 37,5-38°С, рН 7,2-7,4. Ферментирует лактозу с образованием уксусной и L(+)-изомера молочной кислоты. Ферментирует арабинозу, ксилозу, рибозу. Маннозу, маннит, инулин, целлобиозу, сорбит и салицин не ферментирует.

Сбраживает молоко с образованием к 16-18 ч стабильного сгустка. Газообразующая способность, каталазообразующая способность, разжижение желатины отсутствуют. Кислотообразующая активность: при культивировании на стерильном обезжиренном молоке титруемая кислотность достигает к 16 ч – 100°Т, к 20 ч – 160°Т, к 24 ч – 180°Т. Максимальный титр бифидобактерий в сгустке достигает к 16 ч культивирования и составляет 8,3 lg КОЕ/см³; максимальный титр бифидобактерий в стерильном обезжиренном молоке без ростовых факторов через 24 ч культивирования составляет 1-3 lg 9.

Штамм растет на общепринятых в производстве питательных средах с накоплением биомассы не менее lg 8-9 микробного числа за 16-18 ч культивирования (таблица 1).

Таблица 1

Сравнительные данные накопления микробной массы (КОЕ/мл lg 8) и активность кислотообразования (в градусах Тернера) штамма Bifidobacterium longum B 379 M и В.longum В379М-МБ за 16-18 ч культивирования

Из таблицы следует, что заявленный штамм обладает высокой активностью кислотообразования, активно размножается с накоплением производственной биомассы.

Антагонистические свойства, устойчивость к антибиотикам:

Штамм устойчив к антибиотикам: канамицину, линкомицину, амикоцину, ампициллину, бензилпенициллину, стрептомицину, тетрациклину, гентамицину, а также к сульфадимезину (см. таблицу 2).

Определение уровня устойчивости штамма к антибиотикам проводили по методу серийных разведений в жидкой питательной среде – стерильном обезжиренном молоке. В питательную среду вводили различные концентрации стерильных растворов антибиотиков и 16-ти часовую культуру бифидобактерий в количестве 5%. Устойчивость определяли по изменению титруемой кислотности в образцах после 48 ч инкубирования при 37-38°С.

Таблица 2

Антибиотическая устойчивость штамма B.longum B379M-МБ

Полученные данные свидетельствуют о том, что штамм В.longum В379М-МБ устойчив к наибольшим концентрациям следующих антибиотиков: к амикоцину, ампициллину, бензилпенициллину, канамицину, линкомицину, стрептомицину, экстенциллину. олеандомицину, офлаксоцину, сульфадимезину.

Штамм обладает выраженной антагонистической активностью к патогенным и условно патогенным микроорганизмам: Е.coli, S. aureus, Candida albikans, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Shigella sonnei, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis, которые наиболее часто являются причиной пищевых отравлений, возникающих при потреблении кисломолочных продуктов.

У штамма выраженная антиоксидантная активность: супероксиддисмутазная активность штамма – 25,9 ед/мг белка микробной массы.

Условия хранения заявляемого штамма.

Свежеприготовленный В.longum В379М-МБ на питательной среде с массовой долей сухих веществ 14-16% с добавлением защитной среды, содержащей сахарозу, желатозу, лимоннокислый натрий, высушивают сублимационным способом в ампулах. Штамм хорошо хранится при 6-8°С без потери титра активности в течение года.

Основным производственно-полезным признаком штамма В.longum В379М – МБ, отличающим его от штамма В.longum B 379 M, является то, что выращенная в стационарных условиях в стерильном обезжиренном молоке культура обладает выраженной супероксиддисмутазной активностью. СОД-активность штамма B.longum В379М-МБ составляет 25,9±1,4 ед/мг белка, содержащегося в бактериальной массе.

Выявленная СОД-активность культуры бифидобактерий свидетельствует о том, что штамм обладает выраженным пробиотическим действием, которое может проявляться в условиях как in vivo, так и in vitro. Высокая активность кислотообразования, устойчивость штамма к основным антибиотикам способствует эффективному восстановлению нормальной микрофлоры кишечника уже в процессе антибиотикотерапии.

Заявляемый штамм может быть использован в качестве биологически активного начала пробиотической направленности при производстве различных форм бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, кисломолочных продуктов, неферментированных пищевых продуктов, в приготовлении косметических и гигиенических средств. При этом повышается биологическая ценность продуктов функционального питания и препаратов, приготовляемых на его основе. Употребление в пищу продуктов, использующих заявленный штамм, способствует колонизации слизистой кишечника, вытеснению патогенной и условно патогенной микрофлоры, коррегированию кишечного дисбактериоза и способствует восстановлению бифидофлоры.

Установлено, что штамм В.longum В379М-МБ не является бактериогенным и не обладает бактериоциноустойчивостью к штаммам бифидобактерий вида В.bifidum, что позволяет использовать его при совместном культивировании в заквасках, в составе комплексного бакпрепарата или консорциума бифидобактерий.

Использование заявленного штамма в производстве кисломолочных, неферментированных продуктов, биологически активных добавок, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств, например кремов, салфеток, лосьонов, тампонов, питательных масок, женских прокладок, мыла, косметического молока и т.п., обеспечивает пробиотический и бактериологический эффект, способствует восстановлению нормальной микрофлоры, кожных и слизистых покровов, а также направлено на расширение арсенала аналогичных средств.

Пример 1. Использование штамма В.longum В379М-МБ в составе заквасок для приготовления кисломолочных продуктов.

1-й пассаж – Лиофилизированный штамм бифидобактерий в количестве 0,1 г (1 доза) сухой биомассы титруют методом десятикратных разведений до 10^-9 и выращивают при 37,5-38°С до появления отдельных колоний в последних разведениях. Или 1 дозу сухой биомассы вносят в емкость с питательной средой и выращивают до появления отдельных колоний в последних разведениях. Или 1 дозу сухой биомассы штамма вносят в емкость с питательной средой и выращивают до получения биомассы с содержанием клеток не менее 10⁸/мл.

2-й пассаж – Выросшую культуру объемом не более 10% вносят в среду выращивания и культивируют до получения биомассы с содержанием микробных тел не менее 10⁸/мл.

3-й пассаж (продукт) – Полученную биомассу в объеме не более 5% вносят в стерильное молоко и культивируют до образования сгустка, который разливают в емкости и охлаждают. Полученный продукт содержит в 1 мл не менее 10⁸ живых бифидобактерий.

Пример 2. Использование штамма В.longum В379М-МБ в составе биологически активной добавки.

1-й пассаж – Лиофилизированный штамм активизируют путем посева в питательную среду и выращивают при 37-38,5°С до получения биомассы с содержанием клеток не менее 10⁸/мл.

2-й пассаж – Выросшую культуру в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с количеством клеток не менее 10⁸/мл.

3-й пассаж – Полученную маточную культуру в количестве не более 5% вносят в питательную среду и выращивают при 37,5-38°С.

Получение биологически активной добавки – Выросшая биомасса представляет собой жидкий концентрат с высоким, не менее 10⁸/мл, титром бифидобактрий. В концентрат можно вносить различные бифидогенные факторы, способствующие стабилизации свойств культуры и лучшей приживляемости штамма в организме. Концентрат, разлитый в емкости, можно непосредственно использовать в качестве биологически активной добавки лечебно-профилактического действия. Можно получить сухую биологическую активную добавку, для этого к биомассе 3-его пассажа добавляют защитные среды высушивания (сахарозожелатиновую, обезжиренное молоко), суспензию замораживают при температуре не менее -45°С, лиофилизируют, укупоривают и получают сухой концентрат с содержанием бифидобактерий не менее 10⁷/мл, который можно использовать в качестве биологической добавки, внося ее в пищевом сырье непосредственно перед употреблением.

Пример 3. Использование штамма В.longum В379М-МБ для получения бифидосодержащего препарата.

1-й пассаж – Лиофилизированный штамм активизируют путем посева в питательную среду и выращивают при 37-38,5°С до получения биомассы с содержанием клеток не менее 10⁸/мл.

2-й пассаж – Выросшую культуру в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с количеством клеток не менее 10⁸/мл.

3-й пассаж – Полученную маточную культуру в количестве не более 5% вносят в питательную среду и выращивают при 37,5-38°С.

Получение бифидосодержащего препарата – Выросшая биомасса представляет собой жидкий концентрат с высоким, не менее 10⁸/мл, титром бифидобактрий. К биомассе 3-его пассажа добавляют защитные среды высушивания (сахарозожелатиновую, обезжиренное молоко), суспензию замораживают при температуре не менее -45°С, лиофилизируют, укупоривают и получают сухой концентрат с содержанием бифидобактерий не менее 10⁸/мл, который можно использовать в качестве бифидосодержащего препарата.

Пример 4. Использование штамма В.longum В379М-МБ для получения кваса или сока.

1-й пассаж – Лиофилизированный штамм в количестве 0,1 г сухой биомассы активизируют путем посева в питательную среду. Выращивают при 37,5-38°С до получения биомассы с содержанием микробных клеток не менее 10⁸/мл.

2-й пассаж – Выросшую культуру в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с содержанием клеток не менее 10⁸/мл.

3-й пассаж (получение продукта) – Выросшую биомассу в объеме не более 5% вносят в хлебный квас или сок после их пастеризации из расчета, чтобы содержание бифидобактерий в 1 мл кваса или сока составило не менее 10⁸. Квас или сок охлаждают и употребляют без последующего брожения.

Пример 5. Использование штамма В.longum В379М-МБ для получения косметического средства.

1-й пассаж – Лиофилизированный штамм в количестве 0,1 г сухой биомассы активизируют путем посева в питательную среду. Выращивают при 37,5-38°С до получения биомассы с содержанием микробных клеток не менее 10⁸/мл.

2-й пассаж – Выросшую культуру в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с содержанием клеток не менее 10⁸/мл.

3-й пассаж (получение косметического средства) – Выросшую биомассу в объеме не более 5% вносят в биореактор с тиогликолевой средой и инкубируют при 37,5-38°С при слабом перемешивании до достижения титра бифидобактерий 10⁹ клеток/мл. Впоследствии полученную суспензию клеток разрушают нагреванием в автоклаве. Полученную взвесь биологически активных компонентов охлаждают и смешивают с кремовой основой в соотношении 1:2-1:20 в зависимости от назначения изготовляемого крема.

Формула изобретения

Штамм бифидобактерий Bifidobacterium longum В 379М-МБ, ВКПМ Ac-1689, используемый для приготовления кисло-молочных, неферментированных продуктов, биологически активных добавок, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств.

PC4A – Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение

(73) Патентообладатель(и):

Общество с ограниченной ответственностью “Мир биотехнологий (научно-производственное объединение)”

(73) Патентообладатель:

Общество с ограниченной ответственностью “Научно-производственное объединение “Бифилайф”

Дата и номер государственной регистрации перехода исключительного права: 16.07.2008 № РД0038467

Извещение опубликовано: 27.08.2008 БИ: 24/2008