Патент на изобретение №2261903
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ Mycoplasma hominis И СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ УРОГЕНИТАЛЬНЫХ МИКОПЛАЗМОЗОВ
(57) Реферат:
Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для культивирования Mycoplasma hominis и диагностики урогенитальных микоплазмозов путем выделения микоплазм из клинического материала. Питательная среда для выявления Mycoplasma hominis содержит питательную основу, стимуляторы роста, аргинин, лошадиную сыворотку и дистиллированную воду. В качестве питательной основы она содержит сердечно-мозговую вытяжку и триптозу, в качестве стимуляторов роста – дрожжевой экстракт и среду 199, и в качестве селективных добавок – антибиотики, и индикатор. Предложенный способ диагностики инфекций, вызываемых Mycoplasma hominis, включает введение питательной среды, способствующей обнаружению возбудителей заболеваний, в лунки культурального планшета, исследуемого материала, индикатора и вещества, создающего анаэробные условия и анализ изменения цвета питательной среды. В качестве питательной среды используют питательную среду вышеоговоренного качественного и количественного состава компонентов. Способ диагностики прост в постановке, не требует специального оборудования, позволяет проводить как выявление, так и идентификацию возбудителей, определить степень обсемененности и спектр чувствительности к различным антибактериальным препаратам, оценить эффективность проведенного лечения. Использование питательной среды позволяет упростить состав, повысить скорость и точность способа диагностики микоплазменной инфекции за счет повышения чувствительности среды. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 4 табл.
Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для культивирования Mycoplasma hominis и диагностики урогенитальных микоплазмозов путем выделения микоплазм из клинического материала. Этиологическая структура урогенитальных инфекций постоянно меняется. В последнее время резко возросла частота хламидийной, вирусной, микоплазменной, уреаплазменной и смешанной инфекций, борьба с которыми представляет значительные трудности в связи с развивающейся устойчивостью к антибиотикам и особенностями ответных реакций организма. Лабораторная диагностика играет решающую роль в распознавании урогенитальных микоплазмозов. Это тем более важно, что среди людей широко распространено бессимптомное носительство. До недавнего времени традиционными методами являлись бактериологический и серологический методы. Техногенные и другие неблагоприятные экологические и социальные факторы снижают популяционный иммунитет населения, ведут к росту иммунодефицитных состояний и изменению структуры инфекционной патологии. Отмечается увеличение заболеваемости инфекциями, передаваемыми половым путем, в том числе новыми или ранее недостаточно известными. Появление большого числа новых диагностических препаратов и методов требует оптимизации лабораторной диагностики урогенитальных инфекций. Наибольшую диагностическую ценность имеют методы выявления возбудителей и их антигенов. Указанное определяется рядом особенностей урогенитальных инфекций и их возбудителей: их широким распространением и длительностью циркуляции антител после перенесенной инфекции (особенно IgG-антител, выявляемых в иммуноферментном анализе (ИФА)), наличием хронических и латентных форм, частыми микст-инфекциями, высокой серологической гетерогенностью и антигенной изменчивостью, широким спектром перекрестных серологических реакций, низкими титрами специфических иммуноглобулинов при локальных формах инфекций и др. Из патентной литературы известна “ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ МИКОПЛАЗМ”. Для приготовления среды в объем дистиллированной воды добавляют, г: питательный бульон 19,21, эритрит 0,01, тиамин-бромид 0,004, аргинин 0,08, цистин 0,4, глюкоза 0,8, ЭКД 4,0, агар 8,96, Na2CO3 0,64. Среду тщательно 2 перемешивают и доводят до кипения, затем автоклавируют. После остывания в среду добавляют 200 мл лошадиной сыворотки и пенициллин. При посевной дозе 10 млн./кл./мл вырастает 120 колоний. (См. патент РФ №1397481, 1988.) Также известна ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКОПЛАЗМ. Для приготовления среды используют перевар сгустков крови человека (триптический перевар) в качестве питательной основы. В качестве стимулятора роста используют сыворотку крови человека 0(1) группы, истощенную механизмами 10-20 мас.%. В состав среды входят, мас.%: 50%-ный дрожжевой экстракт 8-15; глюкоза 0,5-1; хлористый натрий 0,5-1. Все компоненты перемешивают и объем среды доводят до 100 мл переваром сгустков крови. рН среды 7,4-7,8. Рост микоплазм на 3-4-е сутки. (См. патент РФ №1527256, С 12 N 1/20, 1989.) Наиболее близким к заявляемому способу является “Способ подсчета, обнаружения и идентификации микоплазм в общем и урогенитальных микоплазм в частности, и биологическая среда, специально приспособленная для этой цели”. Способ характеризуется ферментативными реакциями, которые протекают при анаэробных условиях в жидкой среде для выращивания микоплазм, содержащей бульон для культивирования микоплазм, лошадиную сыворотку, ампициллин, бактрим, восстановитель тиогликолят натрия, дрожжевой экстракт, цистеин и аргинин. В качестве цветового индикатора используют феноловый красный. Для создания анаэробных условий используют парафиновое масло. Анализируя изменение цвета индикатора в течение одного – двух дней, делают выводы о наличии микоплазменной инфекции. (См. патент US №5091307, 1992.) Культуральный метод диагностики урогенитальных инфекций для выявления Mycoplasma hominis на селективной жидкой питательной среде является наиболее простым и надежным. Использование этого метода позволяет осуществлять выявление и идентификацию Mycoplasma hominis, а также оценивать степень обсемененности исследуемого материала в цветообразующих единицах (ЦОЕ/мл). Последнее особенно важно для клинической оценки этиологии воспалительных процессов. Имеющим этиологическое значение считается концентрация микоплазм в исследуемом материале не менее 10000 ЦОЕ/мл. Определение чувствительности выделенных культур к антибиотикам и целенаправленное назначение препаратов существенно повышает эффективность проводимой терапии, что выгодно отличает культуральный метод от других методов диагностики урогенитальных микоплазмозов (полимеразной цепной реакции (ПЦР) и реакции иммунофлюоресценции (РИФ)). Культуральный метод диагностики урогенитальных микоплазмозов является более достоверным в сравнении с РИФ, более низкая чувствительность и специфичность которой определяется малыми линейными размерами этих микроорганизмов, выраженной их гетерогенностью и изменчивостью, часто встречающейся низкой концентрацией микоплазм в первичном материале и, соответственно, необходимостью их накопления для выявления, сложностью взятия качественного соскоба для этой реакции. Разработана технология получения селективной питательной среды, что дает возможность проведения идентификации выделенных культур микоплазм и оценки их количества (титра) в образцах. При разработке были получены оптимальные соотношения компонентов селективной жидкой питательной среды для выявления Mycoplasma hominis, что привело к повышению ее чувствительности. Среда обеспечивает рост Mycoplasma hominis, сопровождающийся изменением цвета среды за счет проявления ферментативной активности, и тормозит рост сопутствующих грамположительных и грамотрицательных бактерий и грибов. Питательная среда для выявления Mycoplasma hominis содержит питательную основу, стимуляторы роста, аргинин, лошадиную сыворотку и дистиллированную воду. Отличается тем, что в качестве питательной основы она содержит сердечно-мозговую вытяжку и триптозу, в качестве стимуляторов роста – дрожжевой экстракт и среду 199, и в качестве селективных добавок – антибиотики, и индикатор; при следующем соотношении ингредиентов, г/л:
Питательная среда содержит селективные добавки – антибиотики при следующем соотношении ингредиентов, г/л:
В предложенном составе питательной среды представлено оптимальное количественное соотношение компонентов, концентрация антибиотиков и индикаторного красителя. Предложенный способ диагностики инфекций, вызываемых Mycoplasma hominis, включает введение питательной среды, способствующей обнаружению возбудителей заболеваний, в лунки культурального планшета, исследуемого материала, индикатора и вещества, создающего анаэробные условия и анализ изменения цвета питательной среды. В качестве питательной среды используют питательную основу, стимуляторы роста, аргинин, лошадиную сыворотку, дистиллированную воду, в качестве питательной основы сердечно-мозговую вытяжку и триптозу, в качестве стимуляторов роста – дрожжевой экстракт и среду 199, и в качестве селективных добавок – антибиотики, и индикатор. Способ диагностики прост в постановке, не требует специального оборудования, позволяет проводить как выявление, так и идентификацию возбудителей, определить степень обсемененности и спектр чувствительности к различным антибактериальным препаратам, оценить эффективность проведенного лечения. Использование заявляемого состава питательной среды позволяет упростить состав, повысить скорость и точность способа диагностики микоплазменной инфекции за счет повышения чувствительности среды. Для приготовления основы питательной среды в 650 мл дистиллированной воды растворяют сердечно-мозговую вытяжку (“Becton Dickinson microbiology systems”, США, кат. №237500, 2002 г.) – 18-24 г, триптозу (“Becton Dickinson microbiology systems”, США, кат. №211709, 2002 г.) – 8-12 г, дрожжевой экстракт (“Becton Dickinson microbiology systems”, США, кат. №211929, 2002 г.) – 3-4 г. Полученную основу среды стерилизуют автоклавированием. Отдельно в 100 мл дистиллированной воды растворяют среду 199 сухую (“Sigma”, кат. № М5017, 2002 г.) – 4,7-5,2 г, L-аргинина гидрохлорид (“Sigma”, США, кат. №А3909, 2002 г.) – 5-10 г/л, феноловый красный (“Sigma”, США, кат. № Р5530, 2002 г.) – 0,04-0,07 г; полученный раствор добавок стерилизуют фильтрованием. Для приготовления питательной среды смешивают 650 мл основы среды, 100 мл раствора добавок и 250-300 мл лошадиной сыворотки. Смесь тщательно перемешивают, затем добавляют ампициллина натриевая соль – 0,5-1,0 г, ванкомицина гидрохлорид – 0,1-0,2 г, полимиксина В сульфат – 0,01-0,02 г, амфотерицин В – 0,01-0,02 г, эритромицин – 0,02-0,03 г. Под контролем рН-метра устанавливают рН 6,1-6,3, добавляя по каплям концентрированную соляную кислоту. Пример 1. Для приготовления основы среды в 650 мл дистиллированной воды растворяют сердечно-мозговую вытяжку (“Becton Dickinson microbiology systems”, США, кат. №237500, 2002 г.) – 18 г, триптозу (“Becton Dickinson microbiology systems”, США, кат. №211709, 2002 г.) – 8 г, дрожжевой экстракт (“Becton Dickinson microbiology systems”, США, кат. №211929, 2002 г.) – 3 г. Полученную основу среды стерилизуют автоклавированием. Отдельно в 100 мл дистиллированной воды растворяют среду 199 сухую (“Sigma”, кат. № М5017, 2002 г.) – 4,7 г, L-аргинина гидрохлорид (“Sigma”, США, кат. №А3909, 2002 г.) – 5 г, феноловый красный (“Sigma”, США, кат. № Р5530, 2002 г.) – 0,04 г; полученный раствор добавок стерилизуют фильтрованием. Для приготовления среды смешивают 650 мл основы среды, 100 мл раствора добавок и 250 мл лошадиной сыворотки. Смесь тщательно перемешивают, затем добавляют ампициллина натриевая соль – 0,5 г, ванкомицина гидрохлорид – 0,1 г, полимиксина В сульфат – 0,01 г, амфотерицин В – 0,01 г, эритромицин – 0,02 г. Устанавливают рН 6,1-6,3. Пример 2 (оптимальный). Для приготовления основы среды в 650 мл дистиллированной воды растворяют сердечно-мозговую вытяжку (“Becton Dickinson microbiology systems”, США, кат. №237500, 2002 г.) – 20 г, триптозу (“Becton Dickinson microbiology systems”, США, кат. №211709, 2002 г.) – 10 г, дрожжевой экстракт (“Becton Dickinson microbiology systems”, США, кат. №211929, 2002 г.) – 3 г. Полученную основу среды стерилизуют автоклавированием. Отдельно в 100 мл дистиллированной воды растворяют среду 199 сухую (“Sigma”, кат. № М5017, 2002 г.) – 4,95 г, L-аргинина гидрохлорид (“Sigma”, США, кат. №А3909, 2002 г.) – 7,5 г, феноловый красный (“Sigma”, США, кат. № Р5530, 2002 г.) – 0,05 г; полученный раствор добавок стерилизуют фильтрованием. Для приготовления среды смешивают 650 мл основы среды, 100 мл раствора добавок и 250 мл лошадиной сыворотки. Смесь тщательно перемешивают, затем добавляют ампициллина натриевая соль – 0,75 г, ванкомицина гидрохлорид – 0,15 г, полимиксина В сульфат – 0,01 г, амфотерицин В – 0,015 г, эритромицин – 0,025 г. Устанавливают рН 6,1-6,3. Пример 3. Для приготовления основы среды в 650 мл дистиллированной воды растворяют сердечно-мозговую вытяжку (“Becton Dickinson microbiology systems”, США, кат. №237500, 2002 г.) – 24 г, триптозу (“Becton Dickinson microbiology systems”, США, кат. №211709, 2002 г.) – 12 г, дрожжевой экстракт (“Becton Dickinson microbiology systems”, США, кат. №211929, 2002 г.) – 4 г. Полученную основу среды стерилизуют автоклавированием. Отдельно в 100 мл дистиллированной воды растворяют среду 199 сухую (“Sigma”, кат. № М5017, 2002 г.) – 5,2 г, L-аргинина гидрохлорид (“Sigma”, США, кат. №А3909, 2002 г.) – 10 г, феноловый красный (“Sigma”, США, кат. № Р5530, 2002 г.) – 0,07 г; полученный раствор добавок стерилизуют фильтрованием. Для приготовления среды смешивают 650 мл основы среды, 100 мл раствора добавок и 300 мл лошадиной сыворотки. Смесь тщательно перемешивают, затем добавляют ампициллина натриевая соль – 1 г, ванкомицина гидрохлорид – 0,2 г, полимиксина В сульфат – 0,02 г, амфотерицин В – 0,02 г, эритромицин – 0,03 г. Устанавливают рН 6,1-6,3. Селективная питательная среда должна обеспечивать рост Mycoplasma hominis, сопровождающийся изменением цвета среды с оранжевого на малиновый за счет проявления ферментативной активности, и тормозить рост сопутствующих микроорганизмов (грамположительных и грамотрицательных бактерий, грибов). Способ диагностики урогенитальных микроплазмозов. 1. Разморозить среду при комнатной температуре или на водяной бане при температуре 40°С-45°С. 2. Внести по 0,225 мл питательной среды в 4 последовательные лунки культурального 96-луночного планшета (или 4 микропробирки на 1,5 мл или 0,5 мл). Промаркировать лунки планшета (микропробирки): первую – 3, вторую – 4, третью – 5, четвертую – 6. 3. Тщательно суспендировать на вортексе исследуемый образец. 4. Сделать серию 10-кратных разведений исследуемого образца в питательной среде: внести 0,25 мл исследуемого образца в лунку (микропробирку) 3, тщательно пипетировать, перенести 0,25 мл из полученного разведения в следующею лунку (микропробирку) и повторить процедуру разведения. 5. В 4 последовательные лунки культурального планшета (микропробирки), обозначенные “К-“, внести по 0,200 мл питательной среды и провести процедуру 10-кратного разведения, как описано в п.4, используя вместо исследуемого образца транспортную среду. 6. В каждую лунку планшета (микропробирку) внести по 0,70 мл стерильного минерального масла для создания анаэробной среды. 7. Поместить планшет (микропробирки) в термостат и инкубировать при температуре (37±1)°C. 8. Регистрацию результатов проводят на третьи сутки инкубации в термостате при ежедневном визуальном просмотре посевов и о степени обсемененности материала судят по изменению цвета питательной среды. В качестве транспортной среды используют среду при следующем соотношении ингредиентов, г/л:
Для проведения диагностики используется следующий клинический материал: – соскоб клеток слизистой уретры, цервикального канала, влагалища; – первая порция утренней мочи (осадок, полученный центрифугированием 10 мл первой порции утренней мочи); – секрет предстательной железы (V-0,50-0,10 мл), эякулят (V-0,50-0,10 мл). Ключевым моментом в диагностике возбудителей урогенитальных микоплазмозов являются взятие исследуемого материала и условия его хранения. Необходимо: 1) брать материал до начала проведения антибактериальной терапии; 2) процедура взятия материала должна быть стандартной; 3) важно получить достаточное количество клеток, поскольку микоплазмы является микроорганизмами, колонизирующими клеточную поверхность; 4) не использовать при взятии материала местных антисептиков; 5) тщательное удаление слизи из цервикального канала; 6) взятие уретральных образцов следует проводить не ранее чем через 2-3 часа после мочеиспускания; 7) получение секрета предстательной железы и эякулята проводят непосредственно после мочеиспускания; 8) исследуемый материал помещают в специальную транспортную среду, наилучшим образом обеспечивающую сохранение жизнеспособности микоплазм.
Учет результатов. Учет результатов проводят путем визуального просмотра засеянных планшетов (пробирок). Рост Mycoplasma hominis наблюдается в течение 48-72 часов. Рост Mycoplasma hominis сопровождается изменением цвета питательной среды с оранжевого на малиновый, без помутнения, за счет проявления ферментативной активности, гидролиза аргинина, образования аммиака и сдвига рН. При росте Mycoplasma hominis возможно образование незначительного придонного осадка. Рост отмечается на вторые сутки инкубации. В случае низкой обсемененности материала изменение цвета среды происходит на третьи сутки.
Формула изобретения
1. Питательная среда для выявления Mycoplasma hominis, содержащая питательную основу, стимуляторы роста, аргинин, лошадиную сыворотку и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что в качестве питательной основы она содержит сердечно-мозговую вытяжку и триптозу, в качестве стимуляторов роста – дрожжевой экстракт и среду 199, и в качестве селективных добавок – антибиотики, и индикатор при следующем соотношении ингредиентов, г/л:
2. Питательная среда по п.1, отличающаяся тем, что содержит селективные добавки – антибиотики при следующем соотношении ингредиентов, г:
3. Способ диагностики инфекций, вызываемых Mycoplasma hominis, включающий введение питательной среды, способствующей обнаружению возбудителей заболеваний, в лунки культурального планшета, исследуемого материала и вещества, создающего анаэробные условия и анализ изменения цвета питательной среды, отличающийся тем, что в качестве питательной среды используют питательную основу, стимуляторы роста, аргинин, лошадиную сыворотку, дистиллированную воду, в качестве питательной основы – сердечно-мозговую вытяжку и триптозу, в качестве стимуляторов роста – дрожжевой экстракт и среду 199, в качестве селективных добавок – антибиотики, и индикатор при следующем соотношении ингредиентов, г/л:
которую вносят в лунки культурального планшета, маркируют лунки планшета, суспендируют на вортексе исследуемый материал, делают серию 10-кратных разведений исследуемого образца в питательной среде и повторяют процедуру разведения; в лунки культурального планшета вносят питательную среду и проводят процедуру 10-тикратных разведений, используя транспортную среду; в каждую лунку планшета вносят минеральное масло, создающее анаэробные условия; планшет помещают в термостат и инкубируют при температуре (37±1)°С; регистрацию результатов проводят на третьи сутки инкубации в термостате, при ежедневном визуальном просмотре посевов, а о степени обсемененности материала судят по изменению цвета питательной среды. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве транспортной среды используют питательную среду при следующем соотношении ингредиентов, г/л:
QB4A Регистрация лицензионного договора на использование изобретения
Лицензиар(ы): Общество с ограниченной ответственностью “ИнтерЛабСервис”
Лицензиат(ы): ФГУ науки “Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии” Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ЦНИИЭ РОСПОТРЕБНАДЗОРА)
Договор № РД0008467 зарегистрирован 28.04.2006
Извещение опубликовано: 10.06.2006 БИ: 16/2006
* ИЛ – исключительная лицензия НИЛ – неисключительная лицензия
MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 23.03.2007
Извещение опубликовано: 20.02.2008 БИ: 05/2008
NF4A Восстановление действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение
Дата, с которой действие патента восстановлено: 20.02.2010
Извещение опубликовано: 20.02.2010 БИ: 05/2010
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
