Патент на изобретение №2260937
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТОЛЕРАНТНЫХ К ИОНАМ МЕДИ ОДНОДОЛЬНЫХ РАСТЕНИЙ IN VITRO
(57) Реферат:
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к клеточной инженерии для получения растений полевицы толерантных к ионам меди. Культивируют каллус полевицы в течение 2-3 пассажей на среде Мурасиге-Скуга с 1-3 мг/л с 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой и с 100-200 мг/л меди до получения регенерирующих каллусов. Далее проводят регенерацию на среде Мурасиге-Скуга с 100-150 мг/ л меди и укоренение растений на среде Мурасиге-Скуга с 100-150 мг/ л меди. Изобретение позволяет быстро и эффективно получать растения полевицы с наследственно закрепленной устойчивостью к ионам меди и сохранением высоких декоративных качеств. 2 табл.
(56) (продолжение): CLASS=”b560m”КУЧЕРЕНКО Л.А. и др. “О возможности применения методов культуры изолированных органов и тканей в селекции риса” Тканевые и клеточные культуры в селекции растений. МОСКВА “КОЛОС” 1979, УДК 581.143.6:633.18 стр. 31-38.
Область применения Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к клеточной инженерии, и может быть использовано как в городском хозяйстве, так и для фундаментальных исследований в области общей экологии, физиологии и биотехнологии растений. Уровень техники Действие тяжелых металлов (ТМ) на культивируемые клетки растений исследовано, главным образом, для кадмия. В 80-х годах 20 века было проведено довольно много успешных работ по отбору клеток, толерантных к кадмию, однако получить устойчивые растения не удалось. Практически отсутствовали работы по однодольным растениям. Были выделены клеточная линия дурмана, устойчивая к 250 мМ CdCl24 Медь обладает наибольшей фитотоксичностью среди ТМ, поэтому работ по клеточной селекции на устойчивость к меди практически нет. В большинстве случаев получить растения из линий, устойчивых к высоким концентрациям тяжелых металлов, не удавалось, отсутствуют работы по получению однодольных растений, толерантных к меди. Недостатком данных методов являлось длительное культивирование, которое значительно уменьшало регенерационную способность клеток. Раскрытие изобретения По мнению авторов сущность нашего метода заключается в относительно коротком периоде культивирования, что позволяет сохранить регенерационную способность клеток, и с использованием меди на каждом этапе культивирования, благодаря чему устойчивость сохраняется на уровне целых растений. Устойчивость растений к тяжелым металлам обеспечивается молекулярными и физиологическими механизмами, которые могут быть специфичными как для одного вида растений, так и для целой таксономической группы. Вероятно ведущую роль в устойчивости растений играет ряд соединений, которые участвуют в детоксикации ионов ТМ, поступивших в клетки, и выведении их из цитоплазмы. К таким веществам относятся органические кислоты, а также белки фитохелатины, ферритины и металлотиониены. Задачей нашего метода было исключить вышеизложенные недостатки других методов и получить устойчивые растения газонных трав, которые относятся к однодольным растениям. Данная задача была решена созданием нового способа толерантных ионам меди однодольных растений in vitro, отличающегося тем, что культивирование каллуса проводят в течение 2-3 пассажей на среде Мурасиге-Скуга с 1-3 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой и с 100-200 мг/л меди до получения регенерирующих каллусов, затем проводят регенерацию на среде Мурасиге-Скуга с 100-150 мг/л меди и укоренение растений на среде Мурасиге-Скуга с 100-150 мг/л меди. Добавление CuSO4·5H2O в питательную среду ингибировало рост каллуса (табл.1). Пример 1. Одна и та же степень подавления роста отмечена у овсяницы при дозе Cu 100 мг/л, а у полевицы при дозе 150 мг/л. При содержании меди 100-200 мг/л значительная часть каллусных тканей овсяницы и полевицы погибала в течение 1-2 недель, однако рост выживших каллусов был сопоставим с контролем. При концентрации 300 мг/л и выше каллус газонных трав приобретал голубую окраску, вероятно вследствие интенсивного накопления меди в клетках, выжившие каллусные инокулюмы теряли способность к регенерации растений. Каллус культивировали в течение 2-3 пассажей, увеличение числа пассажей приводило к полной потере регенерационой способности клеток. Пример 2. При концентрации меди 100-150 мг/л были получены каллусы, способные к регенерации (табл.1, графа процент образования эмбриогенного каллуса). При концентрации меди выше 200 мг/л лишь единичные каллусы были способны к регенерации. Регенерацию и укоренение растений проводили на среде Мурасиге-Скуга с 100-150 мг/л меди.
Всего в селективных условиях было получено 80 регенерантов полевицы и 10 регенерантов овсяницы (табл.2). Жизнеспособность последних была крайне низкой, семян получить не удалось. Большинство регенерантов полевицы имели нормальную морфологию и хороший рост. Пять регенерантов зацвели и дали семена. Для проверки устойчивости к высоким концентрациям меди регенеранты полевицы были высажены в почву со 150 мг/л Cu. Около 80% растений, полученных из устойчивых к меди клеток, росли при этой дозе металла так же интенсивно, как в чистой почве. Технический результат Результаты проверки на устойчивость к солям меди показывают, что неожиданно было получено, что 80% полученных растений полевицы обладали высокой устойчивостью к солям меди и эта устойчивость закреплялась в следующих поколениях. Кроме того, всхожесть семян регенеранта полевицы, при концентрации меди – 150 мг/л, была в 3 раза выше, чем у растений, неотселектированных в соответствии с заявляемым способом, а также соли меди не угнетали рост этих растений и не вызывали хлороза.
Формула изобретения
Способ получения толерантных к ионам меди растений in vitro, заключающийся в культивировании каллуса на среде Мурасиге-Скуга и растворе медной соли до получения регенерирующих каллусов, регенерации на среде Мурасиге-Скуга и растворе медной соли до получения растений и укоренения растений на среде Мурасиге-Скуга и растворе медной соли, отличающийся тем, что в качестве растений используют газонную траву полевицу, культивирование каллуса проводят в течение 2-3 пассажей на среде с 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой в концентрации 1-3 мг/л и раствором сернокислой меди в концентрации в пересчете на двухвалентную медь 100-200 мг/л до получения регенерирующих каллусов, затем проводят регенерацию на среде с раствором сернокислой меди в концентрации в пересчете на двухвалентную медь 100-150 мг/л и укоренении растений на среде с раствором сернокислой меди в концентрации в пересчете на двухвалентную медь 100-150 мг/л.
MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 13.02.2006
Извещение опубликовано: 27.10.2007 БИ: 30/2007
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
