Патент на изобретение №2260936

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТОЛЕРАНТНЫХ К ЗАСОЛЕНИЮ ГАЗОННЫХ ТРАВ IN VITRO

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к клеточной инженерии для получения солеустойчивых растений. Культивируют семена газонных трав овсяницы и полевицы до получения каллуса на среде Мурасиге-Скуга от 3 до 10 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой, проводят пассирование каллуса в течение 2-4 пассажей, на среде Мурасиге-Скуга с 1-3 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой и с 1% хлорида натрия до получения регенерирующих каллусов. Далее проводят регенерацию и укоренение растений на среде Мурасиге-Скуга с 1% хлорида натрия. Изобретение позволяет быстро и эффективно получать растения овсяницы и полевицы со стабильной и наследуемой устойчивостью к засолению. 3 табл.

Область применения

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к клеточной инженерии, и может быть использовано как в городском хозяйстве, так и для фундаментальных исследований в области общей экологии, физиологии и биотехнологии растений.

Уровень техники

Данные экологические проблемы решаются неэффективно, погибшие от засоления виды растений заменяются теми же видами, которые ждет та же участь. Решение данной проблемы – создание растений, устойчивых к неблагоприятным факторам мегаполиса.

Наряду с традиционными методами селекции перспективно использовать современные биотехнологические подходы, которые уже хорошо зарекомендовали себя при получении растений, толерантных к различным экологическим стрессовым факторам: засухе, засолению, низким и высоким температурам и др. (Гладков Е.А., Долгих Ю.И., Гладкова О.Н., Гладкова О.В., Глушецкая Л.С. Экологические стрессы у растений. М.: Пасьва, 24 стр., 2004). Применительно к газонным травам подобные работы отсутствуют, хотя нет принципиальных показаний против их использования.

Известно несколько способов получения солеустойчивых растений.

В качестве недостатков данных методов следует отметить, что при длительном культивировании может наблюдаться потеря регенерационной способности культивируемых солеустойчивых клеток.

Однако использование ступенчатой селекции так же, как и длительное культивирование, приводит к значительному уменьшению процента регенерирующих каллусов.

Задачей нашего метода было исключить вышеуказанные недостатки и получить солеустойчивые растения.

Раскрытие изобретения

Данная задача была решена созданием нового способа толерантных к засолению газонных трав in vitro, отличающегося тем, что семена газонных трав овсяницы и полевицы культивируют до получения каллуса на среде Мурасиге-Скуга от 3 до 10 мг/л с 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой (2,4-Д), далее проводили пассирование каллуса в течение 2-4 пассажей, на среде Мурасиге-Скуга с 1-3 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой и с 1% хлорида натрия до получения регенерирующих каллусов, затем проводят регенерацию и укоренение растений на среде Мурасиге-Скуга с 1% хлорида натрия.

По мнению авторов, сущность изобретения состоит в уменьшенном периоде культивирования и в использовании хлорида натрия на каждом этапе культивирования. При концентрации ниже 3 мг/л у полевицы и овсяницы наблюдали интенсивное прорастание семян, процент образования каллуса был невысок. Способ иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1. Эмбриогенный каллус формировался с высокой частотой на семенах обеих трав при концентрации 2,4-Д 3; 5 и 10 мг/л (графа индукция каллуса, табл.1). Затем каллус пересаживали вновь на питательную среду. Культивирование каллуса на средах с высоким содержанием 2,4-Д вело к быстрой потере способности к морфогенезу.

Пример 2. При снижении концентрации 2,4-Д до 1-3 мл удалось повысить частоту регенерирующих растения каллусов до 80% у овсяницы и до 95% у полевицы (графа культивирование каллуса, табл.1).

Для отбора солеустойчивых клонов первичный каллус культивировали на средах с 1 и 2% NaCl в течение 2-4 пассажей.

В ходе отбора происходило изменение выживающих эксплантов: уменьшалась эмбриогенная способность ткани, нерастущие экспланты приобретали темный цвет, некротизировались. Светлые экспланты, увеличившиеся в размере, отбирали для дальнейшей пересадки. Отобранные экспланты помещали вновь на селективную среду с 1% и 2% NaCl.

Пример 3. После двух пассажей на среде с 1% NaCl и у овсяницы, и у полевицы выжило около 30% каллусов. При культивировании в течение трех пассажей выживало 23% каллусов у овсяницы и 21% у полевицы, в течение 4 пассажей выжило 18% каллусов у овсяницы и 16% у полевицы, дальнейшее увеличение пассажей вело к полной потере регенерационной способности каллусной ткани. Для повышения вероятности отбора только устойчивых мутантных вариантов регенерацию растений из отобранных клонов и укоренение также проводили на среде с 1% NaCl. Только 60 каллусов овсяницы и 200 каллусов полевицы сформировали растения, более половины которых погибла при пересадке в почву (табл.2).

При проведении селекции в более жестких условиях (среда с 2% NaCl) значительная часть каллусной ткани теряла жизнеспособность в течение 2 недель. Лишь некоторые клоны сохраняли эмбриогенную способность и имели прирост биомассы. Из них были получены растения-регенеранты, однако с меньшей частотой, чем при проведении селекции на среде с 1% соли. Полученные растения хуже приживались в почве и не дали семян. По-видимому, культивирование клеток на среде с 2% соли вызывает неспецифические повреждения, которые впоследствии снижают выживаемость регенерантов.

Выжившие растения-регенеранты полевицы и овсяницы первоначально выращивали в почве без соли. Затем для проверки солеустойчивости в сосуды с частью растений вносили NaCl. Прирост растений в почве без соли за месяц был одинаковым у исходных растений и регенерантов. В варианте с засолением выживаемость регенерантов была выше выживаемости исходных растений при всех концентрациях NaCl. Средний прирост за месяц у растений, полученных из солеустойчивых клонов, был в 2 раза больше при уровне соли 1% и в три раза при полуторапроцентном засолении. В отличие от пожелтевших исходных растений большая часть регенерантов сохраняла высокие декоративные качества при концентрации NaCl 1%. При дозе NaCl 2% выжили только отдельные регенеранты, для них были характерны пожелтение листьев и заметное отставание в росте.

Семена регенерантов полевицы высаживали в почву с содержанием NaCl – 0,7%. Семена контрольных растений в этих условиях не проросли, хотя в почве без соли они имели всхожесть 95%. Всхожесть семян регенерантов составила около 50%. По степени кустистости и высоте потомки регенерантов на соли не уступали растениям, выращенным в нормальной почве. У отселектированных растений отмечено обильное цветение и завязывание семян в стрессовых условиях.

Технический результат

Результаты табл.1, 2, 3 показывают, что предлагаемый метод является эффективным, особенно для полевицы (табл.3).

По частоте выделения форм с наследуемой толерантностью предлагаемый способ клеточной селекции не уступает индуцированному мутагенезу, но количество нежелательных генетических изменений в предлагаемом способе было меньше.

Процесс получения растений со стабильной и наследуемой устойчивостью при использованной в данной работе биотехнологии занимает два года. Это намного меньше, чем проведение селекции традиционным методом с применением отдаленной гибридизации.

Кроме того, оказалось, что полученные по предлагаемому методу растения устойчивы к бишофиту. По мнению авторов, устойчивость к стрессовым факторам окружающей среды нередко носит неспецифический характер, то есть формы, толерантные к одному фактору могут быть менее чувствительны и к другим. Исходные растения при концентрации бишофита 1% значительно отставали в росте от контрольных, а рост растений, выращенных из семян регенеранта, почти не уступал росту в почве без соли. В следующем поколении 90% проверенных NaCl-устойчивых растений также росли на бишофите лучше, чем контрольные.

Формула изобретения

Способ получения толерантных к засолению газонных трав in vitro, заключающийся в том, что семена растений культивируют до получения каллуса на среде Мурасиге-Скуга, далее проводят пассирование каллуса на среде Мурасиге-Скуга с добавлением хлорида натрия до получения регенерирующих каллусов, затем проводят регенерацию и укоренение растений на среде Мурасиге-Скуга с хлоридом натрия, отличающийся тем, что в качестве семян растений используют семена газонных трав овсяницы и полевицы, культивируют их до получения каллуса на среде с 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой в концентрации 3-10 мг/л, далее проводят пассирование каллуса в течении 2-4 пассажей на среде с 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой в концентрации 1-3 мг/л и с хлоридом натрия в концентрации 1% до получения регенерирующих каллусов, затем проводят регенерацию и укоренение растений на среде с хлоридом натрия в концентрации 1%.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 13.02.2006

Извещение опубликовано: 27.10.2007 БИ: 30/2007