Патент на изобретение №2260802

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ОРГАНИЗМ ПИЩЕВОГО ПРОДУКТА

(57) Реферат:

Изобретение относится к области иммунологии и может быть использовано для определения воздействия на организм пищевого продукта. Сущность изобретения состоит в том, в пробе крови определяют тиол-дисульфидное соотношение (ТДС), инкубируют ее с единичной дозой антигена конкретного пищевого продукта, при этом через 30 минут, 1 час и 3 часа после начала инкубации повторно добавляют последовательно увеличенную в 2, 4 и 8 раз, соответственно, дозу антигена и определяют ТДС с интервалами в 30 минут, 1 час, 3 часа и 24 часа инкубации, строят график зависимости величины ТДС от времени инкубации и вычисляют значение площади под кривой зависимости величины ТДС от времени инкубации. Техническим результатом является разработка способа, позволяющего определить аллергию, пищевую непереносимость или полезность пищевого продукта. 3 з.п. ф-лы, 3 табл.

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, аллергологии, диетологии, и может применяться для диагностики аллергических заболеваний, непереносимости или полезности пищевых продуктов для любого живого организма (человека или животных).

Известен способ диагностики аллергии реакциями нейтрофилов крови (В.А.Фрадкин, 1985), основанный на показателе повреждения нейтрофилов.

Недостатком описанных способов является неспецифичность теста с повреждением нейтрофилов крови и отсутствие регламентации для его использования при определении непереносимости пищевых продуктов. Кроме того, тестирование с употреблением подозрительных на аллергию пищевых продуктов in vivo занимает длительный период времени (в день тестируется реакция на один или небольшое число пищевых аллергенов) и может способствовать развитию побочных реакций или осложнений для пациента.

Наиболее близким по сути к заявляемому является способ диагностики аллергических заболеваний (см. патент РФ № 2098826, МПК 6 G 01 N 33/53, 33/48, опубл. 10.12.1997 г.) путем постановки нагрузочного теста с антигеном теофиллином in vitro и одновременного определения показателей крови, по изменению которых проводят диагностику, при этом одновременно с постановкой теста с теофиллином в качестве антигена для определения показателей крови проводят реакцию спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана и при количестве розеткообразующих нейтрофилов, равном 1067 в 1 мкл крови и ниже, а теофиллинрезистентных Т-лимфоцитов – 27% и ниже, – диагностируют аллергическое заболевание.

Основным недостатком этого способа является недостаточная информативность для диагностики различных форм аллергических заболеваний, а также существенная неспецифичность метода оценки иммунных нарушений, что сужает область его практического применения. При этом не разработаны условия для диагностики пищевой аллергии и непереносимости пищевых продуктов, не определены условия для объективной оценки возможного полезного влияния тестируемого вещества на организм.

В основу изобретения поставлена задача такого усовершенствования способа диагностики аллергии, пищевой непереносимости и полезности пищевых продуктов, при котором за счет использования в качестве антигена тестируемого вещества и определения в качестве показателей крови тиол-дисульфидного соотношения (ТДС) расширяется область диагностики различных видов аллергии, в том числе и пищевой. Кроме того, появляется возможность диагностики непереносимости пищевых продуктов или их полезного влияния на исследуемый организм. Предлагаемый способ позволяет проводить одновременное тестирование практически неограниченного количества аллергенов in vitro, что является еще и абсолютно безопасным для пациента.

Причинно-следственная связь между предлагаемой совокупностью признаков и достигаемыми медицинскими результатами состоит в следующем.

Каждый биологический индивидуум имеет неповторимый генотип, который реализуется индивидуальным спектром биохимических и ферментативных реакций, в том числе и для взаимодействия с продуктами питания, пищевыми добавками, лекарственными или иными употребляемыми веществами. В зависимости от возможного результата такого взаимодействия реакция на организм может быть оценена как полезная, вредная или индифферентная. Установить объективные критерии такого влияния на биохимические процессы помогает именно предлагаемый способ, который позволяет оценить воздействие тестируемых экзогенных веществ на характер протекающих окислительно-восстановительных процессов, баланс про-антиоксидантного состояния, а также уровень неспецифической резистентности и адаптационных возможностей организма через оценку состояния тиол-дисульфидного обмена. По своей сути, тиол-дисульфидное соотношение в крови на уровне макроорганизма отражает интегральный биохимический баланс здоровье-болезнь. Вещества, способствующие повышению восстановительных процессов в организме, потенциально могут играть роль полезных для здоровья факторов, а влияющие в обратном направлении, – наоборот, усугублять недостаточность адаптационных механизмов или способствовать ухудшению биохимического и физиологического гомеостаза, а также развитию патологических процессов.

Для выбора диагностических критериев проводили исследования у 37 лиц с аллергическими заболеваниями, а также у 78 пациентов с отсутствием аллергии с использованием комплекса биохимических тестов и методов аллергологической диагностики in vitro. Для выявления аллергии к различным аллергенам (пыльцевым, бытовым, лекарственным, инфекционным, пищевым) применяли скарификационный метод, а также нагрузочный тест с конкретным антигеном в крови in vitro. При постановке нагрузочного теста у пациента производили забор крови из локтевой вены в объеме 15 мл, смешивали ее с 5% раствором цитрата натрия. Затем нитратную кровь инкубировали с различными аллергенами, причем через 30 минут, 1 час и 3 часа после начала инкубации в пробирку с кровью повторно добавляли последовательно увеличенную в 2, 4 и 8 раз, соответственно, дозу конкретного аллергена. Одновременно перед началом инкубации, а затем через 30 минут, 1 час, 3 часа и 24 часа инкубации крови с аллергеном определяли содержание тиоловых (-SH) и дисульфидных (-SS-) групп в лизате цельной крови методом амперометрического титрования с нитратом серебра, после чего вычисляли тиол-дисульфидное соотношение:

([-SH]/[-SS-]=ТДС).

Таким образом, исследовали ТДС в крови в динамике с интервалами в 30 минут, 1 час, 3 часа, 24 часа инкубации при эскалационном повышении вводимой в кровь in vitro дозы тестируемого аллергена, начиная от 1 дозы (исходно), затем – 2 дозы (добавляемых в кровь через 30 минут после инкубации 1 дозы), затем – 4 дозы (добавляемых через 30 минут после 2 доз) и, наконец, добавляли еще 8 доз аллергена (через 2 часа после предыдущего введения 4 доз аллергена); всего за исследование в кровь вводилось 1+2+4+8=15 доз тестируемого аллергена. В контроле вместо аллергена в аналогичные интервалы времени вводился физиологический раствор (отрицательный контроль) или в аналогичном режиме увеличивающиеся дозы гистамина (положительный контроль). После этого строили график зависимости величины ТДС от времени инкубации и сравнивали площади под этой зависимостью по сравнению с контрольными показателями (

AUC в пределах -40%-+20%), и этот показатель приближался к положительному контролю (в реакции с гистамином). При отсутствии аллергии, но с наличием клинических признаков непереносимости пищевых продуктов показатели AUC колебались в пределах 60-30%. Полезное влияние пищевых продуктов расценивалось при показателях AUC не менее 100%. Кроме того, уменьшение AUC в пределах от 99% до 60% не имело существенной отрицательной реакции на организм и было оценено нами как индифферентное.

Пример 1.

AUC (в пределах 59-28% по сравнению с отрицательным контролем) при тестировании еще 9 пищевых продуктов (рыба карп, минтай, хек, тыква, овсяная, ячменная, гречневая крупа, малина, зеленый чай), что расценено, как показатели их непереносимости. Среди 12 пищевых продуктов (желток куриного яйца, рисовая и пшенная крупа, ржаная мука, свекла, яблоко, банан, смородина, слива, виноград, лук, кофе) выявлено минимальное снижение AUC (в пределах 99-60% по сравнению с отрицательным контролем), которое было расценено как индифферентное действие. И, наконец, при тестировании еще 27 пищевых продуктов отмечалось увеличение показателя AUC выше отрицательного контроля (принятого за 100%), что предполагало их полезное влияние на организм.

После исключения из питания аллергенных пищевых продуктов (элиминационная диета) и употребления преимущественно продуктов с прогностически полезным действием на организм (включая и индифферентные), признаки аллергического дерматита регрессировали в течение 4-х недель без применения какого-либо дополнительного лечения.

Пример 2.

AUC=44%) и с антигеном груши (уменьшение на 44%, AUC=56%), не достигавшее, однако, величин положительного контроля ( AUC в реакции с гистамином = -3%), что расценено как проявление не аллергии, а пищевой непереносимости. Наблюдалось менее выраженное уменьшение AUC (в пределах 99-60%) при тестировании еще 11 пищевых продуктов (рыба карп, минтай, гречневая и рисовая крупа, кукурузная мука, картофель, капуста, орех грецкий, дыня, смородина, вишня), расцененное как индифферентное действие. Выявлено также повышение (в пределах AUC100%) показателей ТДС-теста с 39 продуктами питания.

Исходя из полученных результатов, пациенту было рекомендовано употребление только тех пищевых продуктов, которые способствовали в тесте in vitro увеличению или, как минимум, не способствовали уменьшению показателя ТДС в крови, что отражало, по-видимому, их положительное влияние на окислительно-восстановительный баланс и уровень неспецифической резистентности макроорганизма. Применение такой индивидуальной диеты в течение 4-х недель способствовало полному восстановлению нормального самочувствия пациента, повышению работоспособности, хорошей переносимости употребляемой пищи.

Вследствие реализации предлагаемых отличий, которые по своей сути являются новыми критериями для оценки влияния на живой организм тестируемого вещества, диагностики пищевой аллергии или пищевой непереносимости, обеспечиваются следующие преимущества предлагаемого способа: 1) способ осуществляется простым и доступным методом, что может быть выполнимо не только в иммунологической или аллергологической, но и в любой общеклинической лаборатории;

2) отсутствует опасность провоцирования у пациента побочных или аллергических реакций; 3) способ позволяет проводить одновременное тестирование практически неограниченного количества аллергенов;

4) методика тестирования крови с помощью ТДС-реакции на аллергены позволяет выявлять и дифференцировать не только аллергическую реакцию, но также неиммунологические формы аллергии или непереносимость пищевых продуктов;

Формула изобретения

1. Способ определения воздействия на организм пищевого продукта, заключающийся в том, что в пробе крови определяют тиол-дисульфидное соотношение (ТДС), инкубируют ее с единичной дозой антигена конкретного пищевого продукта, при этом через 30 мин, 1 ч и 3 ч после начала инкубации повторно добавляют последовательно увеличенную в 2, 4 и 8 раз соответственно дозу антигена и определяют ТДС с интервалами в 30 мин, 1 ч, 3 ч и 24 ч инкубации, строят график зависимости величины ТДС от времени инкубации и вычисляют значение площади под кривой зависимости величины ТДС от времени инкубации.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при уменьшении площади под кривой зависимости ТДС от времени инкубации до значений, полученных при инкубации с гистамином в качестве антигена (положительного контроля), определяют аллергическое действие тестируемого пищевого продукта.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что при уменьшении площади под кривой зависимости ТДС от времени инкубации по сравнению с отрицательным контролем, определяют непереносимость тестируемого пищевого продукта.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что при увеличении площади под кривой зависимости ТДС от времени инкубации по сравнению с отрицательным контролем, определяют полезное действие тестируемого пищевого продукта.