Патент на изобретение №2260044

(54) ШТАММ KLEBSIELLA PNEUMONIAE ВКПМ В-7001, ДОНОР ГЕНОВ ARS-ОПЕРОНА, ДЛЯ СОЗДАНИЯ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ-БИОДЕСТРУКТОРОВ МЫШЬЯКСОДЕРЖАЩИХ СОЕДИНЕНИЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и может быть использовано в химической промышленности. Получен штамм Klebsiella pneumoniae ВКПМ В-7001, который содержит конъюгативную плазмиду рВК1, детерминирующую устойчивость данного сообщества микроорганизмов к соединениям мышьяка. Использование предложенного штамма позволяет получить штаммы бактерий-биодеструкторов соединений, содержащих мышьяк.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”RU 2024079 C1, 30.11.1994. US 5545799, 13.08.1996.

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для конструирования штаммов микроорганизмов с усиленной биодеструктивной активностью, перспективных для использования в биотехнологии утилизации люизита.

Вследствие высокой токсичности соединений мышьяка, в том числе и для микроорганизмов, в биотехнологических целях могут быть использованы лишь штаммы бактерий, резистентные к соединениям мышьяка.

Недостатком таких штаммов и содержащихся в них плазмид является неизученность с точки зрения их “технологичности”, необходимой для адаптации микробов к условиям определенного биотехнологического цикла.

Стоимость штаммов, депонированных в зарубежных коллекциях, довольно высока. Необходимость их “генетической доработки” для усиления деструктивной активности при повышенных концентрационных пределах токсического действия соединений мышьяка делает нерентабельным их приобретение из-за рубежа, что предопределяет поиск и выделение природных штаммов микроорганизмов с повышенной резистентностью к соединениям мышьяка из окружающей среды, а также из популяции клинических изолятов, в том числе и патогенных бактерий.

Задачей изобретения является выделение из различных экологических ниш штаммов микроорганизмов с повышенной резистентностью к соединениям мышьяка, сравнительное изучение их биологических свойств и поиск плазмид, детерминирующих устойчивость штаммов бактерий к соединениям мышьяка.

Технический результат, который может быть достигнут при использовании штамма К. pneumoniae ВКПМ В-7001, – возможность получения генов ars-оперона для конструирования штаммов микроорганизмов-деструкторов люизита, пригодных для биотехнологической утилизации данного ксенобиотика.

В бактериях штамма обнаружена конъюгативная плазмида рВК1 (25 МДа), детерминирующая резистентность к соединениям мышьяка и множественную лекарственную устойчивость. Штамм депонирован в коллекции микробных культур НИИ микробиологии МО РФ и Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИГенетика (коллекционный номер ВКПМ В-7001).

Штамм характеризуется следующими признаками.

При выращивании бактерий в бульоне на основе ферментативного гидролизата мяса в течение 48 часов при температуре 37°С образуется равномерная муть. На плотной питательной среде вырастают куполообразные, блестящие, пышные, слизистые колонии. На питательных средах Эндо и Плоскирева бактерии формируют красные колонии с металлическим блеском. Цитрат и глюкозу бактерии используют в качестве единственных источников углерода, а аммиак – как источник азота.

Морфология клеток.

Грамотрицательные прямые неподвижные палочки размером 0, 3…1, 5×0,6 мкм, имеющие выраженную капсулу. В мазках бактерии располагаются одиночно, парами или короткими цепочками. Бактерии спор не образуют, лишены жгутиков.

Физиолого-биологические признаки штамма.

Факультативный анаэроб, каталазоположительный оксидазоотрицательный. Образует 2,3-бутандиол в качестве главного конечного продукта сбраживания глюкозы. Реакция Фогеса-Проскауэра положительная. Глюкоза сбраживается с образованием кислоты и газа. Ферментирует лактозу, дульцит. На среде TSI (среда с железом и сахарами) сероводород не образует. Обладает уреазной активностью. Желатиназу и индол не образует.

Оптимальная температура для роста 35…37°С. Оптимальное значение рН среды 7,2.

Бактерии штамма устойчивы к ампициллину, тетрациклину, хлорамфениколу, стрептомицину, канамицину, триметоприму, налидиксовой кислоте; чувствительны к рифампицину.

В бактериальных клетках имеются четыре плазмиды с молекулярной массой (МДа): 25,0; 55,0; 72,0; 87,0. Плазмида pBK1 имеет молекулярную массу 25 МДа, конъюгативна, детерминирует устойчивость к соединениям мышьяка и множественную лекарственную устойчивость. Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) для As (V) – 36 мг · мл^-1, для As (III) – 58 мг · мл^-1 (в пересчете на чистый мышьяк).

Бактерии штамма авирулентны для лабораторных животных.

Способ, условия и состав сред для хранения бактерий штамма.

Штамм K.pneumoniae ВКПМ В-7001 хранится в лиофилизированном состоянии в ампулах под вакуумом при температуре минус 20°С. Защитная среда при высушивании – сахароза 10%, желатина 4%, рН среды 7,2±0,2.

Способ, условия и состав сред для размножения бактерий штамма K.pneumoniae ВКПМ В-7001.

Бактерии выращивают при температуре 35…37°С на питательной среде следующего состава:

КН₂PO₄ – 8,8 г,

NaOH – 1,4 г,

сухой экстракт кормовых дрожжей – 5,2 г,

мясной гидролизат – 10,0 мл,

дистиллированная вода до 1,0 л.

рН среды – 7,2±0,1. (Питательная среда для культивирования микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae и неферментирующих грамотрицательных бактерий: патент РФ №1745766 1992 г.).

Для приготовления плотной питательной среды в жидкую питательную среду приведенного состава добавляют 15,0 г агар-агара, стерилизуют 30 минут при температуре 121°С и разливают растопленную и остуженную до температуры 50°С среду в стерильные чашки Петри.

Для оценки устойчивости бактерий K.pneumoniae ВКПМ В-7001 к мышьяку используют соединения, содержащие мышьяк различной валентности: As₂O₃(III) и Na₃AsO₄ (V). В качестве количественной характеристики резистентности бактерий к соединениям мышьяка используют показатель МИК (минимальная ингибирующая концентрация). Клеточную суспензию исследуемых бактерий и контрольного штамма Escherichia coli 803 в физиологическом растворе NaCl (1·10⁷ микробов · мл^-1) наносят в виде капли на плотную питательную среду вышеприведенного состава, содержащую различные концентрации соединений мышьяка. Растворы последних готовят и предварительно стерилизуют путем фильтрования с использованием фильтров с диаметром пор 25 мкм фирмы “Sartorius”. Посевы микробных культур на питательные среды в чашках Петри выращивают в течение 40 часов при температуре 37°С, после чего учитывают интенсивность роста по сравнению с контролем (посев бактерий на плотную питательную среду без ингибирующих добавок).

Для подавляющего большинства штаммов бактерий значения МИК As (III) составляют (0,15…0,60) мг · мл^-1, As (V) (0,18…0,54) мг · мл^-1 в пересчете на чистый мышьяк, в частности для бактерий штамма E.coli 803 – 0,18 мг · мл^-1, 0,32 мг · мл^-1 соответственно. МИК для бактерий штамма K.pneumoniae ВКПМ В-7001 As(III) составляет 58 мг · мл^-1, As(V) – 36 мг · мл^-1.

Из четырех плазмид, содержащихся в бактериях штамма K.pneumoniae ВКПМ В-7001, лишь одна детерминирует резистентность к мышьяку – конъюгативная плазмида рВК1, имеющая молекулярную массу 25 МДа. Конъюгационную передачу плазмиды рВК1 осуществляют в реципиентный штамм кишечной палочки. В качестве реципиента используют устойчивый к рифампицину штамм Escherichia coli 803 Rif^r (МИК для бактерий реципиентного штамма As(III, V) составляет – 0,32 мг · мл^-1 в пересчете на чистый мышьяк).

Конъюгационную передачу плазмидной ДНК рВК1 осуществляют согласно руководству (Миллер ДЖ. Эксперименты в молекулярной генетике. Пер. с англ. / Под ред. С.И.Алиханяна. М.: Мир, 1976) при скрещивании донорных и реципиентных бактериальных клеток в жидкой питательной среде. Отбор выросших трансконъюгатов проводят с поверхности плотных селективных питательных сред с антибиотиками: рифампицином в сочетании с антибактериальными препаратами, к которым устойчивы бактерии K.pneumoniae ВКПМ В-7001.

Трансконъюгаты E.coli 803Rif^r (pBK1) вместе с резистентностью к мышьяку (МИК > 14 мг · мл^-1) приобретают устойчивость к тетрациклину, хлорамфениколу, стрептомицину и ампициллину.

Положительной характеристикой штамма K.pneumoniae ВКПМ В-7001 является наличие в его бактериях конъюгативной плазмиды pBK1 с генетической детерминантой резистентности к соединениям мышьяка и маркерами резистентности к 4 антибактериальным препаратам, облегчающим последующие генитические манипуляции, связанные с конструированием рекомбинантных плазмид, их передачей в соответствующие реципиентные штаммы бактерий и исследованием рекомбинантных плазмид в новом генетическом окружении.

Формула изобретения

Штамм Klebsiella pneumoniae ВКПМ В-7001, содержащий конъюгативную плазмиду рВК1, донор генов ars-оперона, для создания штаммов бактерий-деструкторов мышьяксодержащих соединений.

PC4A Государственная регистрация перехода исключительного права без заключения договора

(73) Патентообладатель(и):

Научно-исследовательский институт микробиологии Министерства обороны Российской Федерации

(73) Патентообладатель:

Федеральное государственное учреждение “48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны Российской Федерации”

Дата и номер государственной регистрации перехода исключительного права: 08.06.2010 № РП0000819

Извещение опубликовано: 20.07.2010 БИ: 20/2010