Патент на изобретение №2258935

(54) КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АЛЛОАНТИТЕЛА К ФАКТОРУ VIII

(57) Реферат:

Изобретение относится к области иммунологии и гематологии, точнее к способу определения наличия у млекопитающего каталитических алло-антител к фактору VIII, способных расщеплять фактор VIII, и определения характеристик сайтов в указанной молекуле фактора VIII, где происходит расщепление указанными каталитическими алло-антителами к фактору VIII. Сущность изобретения состоит также в разработке ингибитора расщепления фактора VIII, катализируемого алло-антителами к фактору VIII; и к фармацевтической композиции, содержащей указанные каталитические алло-антитела к фактору VIII, которые способны расщеплять фактор VIII и которые получены в процессе осуществления указанного способа определения; и далее к фармацевтической композиции, содержащей указанный ингибитор расщепления фактора VIII, катализируемый указанными алло-антителами к фактору VIII. Изобретение относится и к терапевтическому применению указанного ингибитора расщепления фактора VIII, катализируемого указанными алло-антителами к фактору VIII, фармацевтической композиции, содержащей указанные каталитические алло-антитела к фактору VIII, которые способны расщеплять фактор VIII и которые получены в процессе осуществления указанного способа определения; а также фармацевтической композиции, содержащей указанный ингибитор расщепления фактора VIII, катализируемый указанными алло-антителами к фактору VIII. Технический результат – расширение арсенала терапевтических средств при патологии, связанной с нарушением метаболизма фактора VIII крови. 16 н. и 31 з.п. ф-лы, 1 табл., 5 ил.

Изобретение относится к способу определения наличия у млекопитающего каталитических алло-антител к фактору VIII, способных расщеплять фактор VIII, и получения характеристик сайтов расщепления молекулы указанного фактора VIII указанными каталитическими антителами к фактору VIII.

Настоящее изобретение относится также к ингибитору расщепления (деградации) фактора VIII, катализируемого алло-антителами к фактору VIII.

Далее настоящее изобретение относится к фармацевтическому составу, содержащему указанные каталитические алло-антитела к фактору VIII, которые способны расщеплять фактор VIII и которые получены в процессе осуществления указанного способа определения, и к фармацевтической композиции, содержащей указанный ингибитор расщепления фактора VIII, катализируемого алло-антителами к фактору VIII.

Наконец, настоящее изобретение относится к терапевтическому применению указанного ингибитора расщепления фактора VIII, катализируемого алло-антителами к фактору VIII, фармацевтической композиции, содержащей указанные каталитические алло-антитела к фактору VIII, которые способны расщеплять фактор VIII и которые получены в процессе осуществления указанного способа определения, и фармацевтической композиции, содержащей указанный ингибитор расщепления фактора VIII, катализируемого алло-антителами к фактору VIII.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Гемофилия А – это связанное с Х-хромосомой рецессивное нарушение, приводящее к дефектности или дефициту молекул фактора VIII, которое в острой форме является опасным для жизни и лишающим трудоспособности геморрагическим заболеванием.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Заявителями было сделано открытие, не вытекавшее из предыдущего опыта, о расщеплении фактора VIII алло-антителами двух пациентов с высоким иммунным ответом, имеющих острую гемофилию А, что выявило неизвестный доселе механизм, по которому ингибиторы фактора VIII могут препятствовать прокоагулянтной функции фактора VIII.

Открытие заявителями каталитических алло-антител к фактору VIII является, насколько известно, первым описанием появления каталитических антител, которые индуцируются при введении пациентам фактора VIII. Поэтому считалось неожиданным, даже абсурдным или невероятным, что в присутствии фактора VIII образуются антитела, которые действительно делают молекулу фактора VIII неактивной путем каталитического гидролиза (протеолиза). Однако известные до настоящего времени каталитические антитела все являются ауто-антителами, обнаруживаемыми в процессе заболевания или при физиологических условиях. Поэтому все индуцируемые антитела названы АПЛО-антителами, происхождение которых явно отличается от происхождения АУТО-антител в любом аутоиммунном заболевании.

Рассчитанные значения средней K_m и кажущейся V_max для реакции антител к фактору VIII одного из пациентов составляли соответственно 9,46±5,62 мкМ и 85±60 фемтомоль·мин^-1. Кинетические параметры гидролиза фактора VIII заставляют предположить наличие функциональной роли каталитического иммунного ответа в инактивации фактора VIII in vivo.

Поэтому определение характеристик алло-антител к фактору VIII как сайт-специфических протеаз обеспечивает новые подходы к лечению заболеваний у пациентов, имеющих алло-антитела к фактору VIII.

Таким образом, в соответствии с первым аспектом, настоящее изобретение предусматривает способ определения наличия у млекопитающего каталитических алло-антител к фактору VIII, способных расщеплять фактор VIII, отличающийся тем, что он включает:

– i) выделение плазмы из образца крови, взятого у указанного млекопитающего;

– ii) выделение из указанной плазмы алло-антител к фактору VIII;

– iii) приведение указанных алло-антител к фактору VIII в контакт с фактором VIII на период времени, достаточный для обеспечения расщепления указанного фактора VIII указанными алло-антителами к фактору VIII; и

– iv) определение, после указанного периода времени, эффективно ли указанные алло-антитела к фактору VIII расщепили указанный фактор VIII.

Согласно варианту осуществления этапа (ii) способа по настоящему изобретению, алло-антитела к фактору VIII выделяют из плазмы, объединяя их с фактором VIII, причем указанный фактор VIII предпочтительно связан с носителем (матриксом). Удобно, чтобы на этапе (ii) алло-антитела к фактору VIII были выделены с помощью аффинной хроматографии. Предпочтительно, чтобы на этапе (ii) указанная аффинная хроматография включала использование в качестве носителя сефарозы, предпочтительно активированной цианоген-бромидом.

Согласно варианту осуществления этапа (iii) способа по настоящему изобретению, указанный фактор VIII помечен метящим агентом, предпочтительно радиоактивно-метящим агентом – таким, в частности, как ¹²⁵I. Предпочтительно, чтобы на этапе (iii) указанный фактор VIII был приведен в контакт с алло-антителами к фактору VIII на период времени от приблизительно 0,5 часа до приблизительно 30 часов, предпочтительно около 10 часов, при температуре от приблизительно 15°С до приблизительно 40°С, предпочтительно 38°С.

Согласно варианту осуществления этапа (iv) способа по настоящему изобретению, определение того, эффективно ли указанный фактор VIII был расщеплен указанными алло-антителами к фактору VIII, проводится способом определения, включающим метод разделения – такой, как электрофорез в геле, как, в частности, электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE), или гель-фильтрационная хроматография – такая, как, в частности, быстрая жидкостная гель-фильтрационная хроматография белков, и технику визуализации – такую, как, в частности, авторадиографию.

В соответствии со следующим вариантом осуществления способа по настоящему изобретению, для этого способа характерно то, что он дополнительно включает:

– v) получение характеристик сайта (сайтов) молекулы указанного фактора VIII, в котором (которых) происходит расщепление указанными алло-антителами к указанному фактору VIII.

Согласно варианту осуществления этапа (v) способа по настоящему изобретению, указанное получение характеристик осуществляют, приводя указанный фактор VIII в контакт с указанными алло-антителами к фактору VIII, способными расщеплять фактор VIII, разделяя и затем секвенируя полученные вследствие такой процедуры фрагменты фактора VIII. Удобно осуществлять такое разделение, используя такую технику, как электрофорез в геле – такой, как, в частности, SDS-PAGE, или гель-фильтрацию. Указанное секвенирование удобно осуществлять, используя такую технику, как N-концевое секвенирование, в частности, с использованием автоматического белкового микросеквенатора. С использованием указанного секвенирования локализованы следующие способные к расщеплению связи: Arg³⁷²-Ser³⁷³, находящаяся между доменами А1 и А2, Tyr¹⁶⁸⁰-Asp¹⁶⁸¹, находящаяся на N-конце домена A3, и Glu¹⁷⁹⁴-Asp¹⁷⁹⁵, находящаяся внутри домена A3 молекулы фактора VIII.

Таким образом, согласно второму аспекту, настоящее изобретение предлагает аминокислотную последовательность:

– Ser Val Ala Lys Lys His Pro;

аминокислотную последовательность:

– Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser; и

аминокислотную последовательность:

– Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu.

Настоящее изобретение распространяется также на варианты или аналоги такой или любой иной последовательности фактора VIII, которые способны ингибировать любой сайт в молекуле фактора VIII, чувствительный к лизису алло-антителами к фактору VIII. В контексте настоящего изобретения таким вариантом может быть, например, пептидный или непептидный аналог аминокислотной последовательности, описанной выше, который ингибирует любой сайт в молекуле фактора VIII, чувствительный к лизису алло-антителом к фактору VIII. Таким вариантом может быть, например, вариант последовательности, который короче на несколько аминокислот, например, на N-конце, на С-конце или на обоих концах, или длиннее на несколько аминокислот (такие варианты можно получить химическим синтезом или ферментативным расщеплением существующей в природе молекулы), при условии, что этот вариант ингибирует любой сайт в молекуле фактора VIII, чувствительный к лизису алло-антителами к фактору VIII.

Поэтому согласно третьему аспекту, настоящее изобретение предусматривает ингибитор расщепления фактора VIII, катализируемого алло-антителами к фактору VIII. Предпочтительно этот ингибитор отличается тем, что он включает в себя ингибитор протеазы. Примерами ингибиторов протеазы, которые могут быть использованы в контексте настоящего изобретения как ингибиторы расщепления фактора VIII, катализируемого алло-антителами к фактору VIII, но не ограничиваясь ими, являются ингибиторы типа фторидов – такие, как, например, PMSF (фенилметилсульфонил-фторид) или AEBSF (4-(2-аминоэтил)бензилсульфонилфторид гидрохлорид (особенно продаваемый фирмой Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, под товарным знаком Pefabloc®). Более конкретно, для этого ингибитора характерно, что указанный ингибитор ингибирует (подавляет) расщепление чувствительных к расщеплению связей: Arg³⁷²-Ser³⁷³, находящейся между доменами А1 и А2, Tyr¹⁶⁸⁰-Asp¹⁶⁸¹, находящейся на N-конце домена A3, и Glu¹⁷⁹⁴-Asp¹⁷⁹⁵, находящейся внутри домена A3 молекулы фактора VIII. Еще более предпочтительно, для этого ингибитора характерно то, что он представляет собой пептидный или непептидный аналог аминокислотной последовательности:

– SerVal Ala Lys Lys His Pro;

пептидный или непептидный аналог аминокислотной последовательности:

– Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser; или

пептидный или непептидный аналог аминокислотной последовательности:

Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu.

Ингибиторы расщепления фактора VIII, как они были определены выше, так же как и их соли замещения, в особенности их фармацевтически приемлемые соли замещения, имеют ценные фармакологические показатели, так как они проявляют нейтрализующую активность по отношению к алло-антителам к фактору VIII.

Эти свойства обосновывают их применение в терапии, и настоящее изобретение дополнительно относится к указанным выше ингибиторам расщепления фактора VIII, а также к их солям замещения, в особенности к их фармацевтически приемлемым солям замещения, в качестве лекарств.

Таким образом, они в особенности показаны для лечения заболеваний, в частности, гемофилического происхождения, более конкретно – заболеваний, связанных с дефектами свертывания крови вследствие недостаточности фактора VIII.

Можно упомянуть в качестве примера применение указанных веществ для лечения, с одной стороны, пациентов с высоким иммунным ответом, имеющих такие заболевания, как, например, слабая или острая гемофилия А (в случаях, когда у этих пациентов обнаружены каталитические антитела), и/или с другой стороны, пациентов, страдающих, к примеру, аутоиммунными заболеваниями (в случаях, когда у этих пациентов обнаружены каталитические антитела).

Таким образом, согласно четвертому принципиальному аспекту, настоящее изобретение обеспечивает решение длительное время существовавшей проблемы создания фармацевтической композиции, отличающейся тем, что она содержит фармацевтически эффективное количество по меньшей мере одного типа алло-антител к фактору VIII, способных расщеплять фактор VIII, как определено выше, в особенности таких, какие можно получить в процессе описанного выше способа, или одной из их фармацевтически приемлемых солей, включенных в фармацевтически приемлемый наполнитель, растворитель или носитель.

Далее, согласно пятому принципиальному аспекту, настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, отличающуюся тем, что она содержит фармацевтически эффективное количество по меньшей мере одного ингибитора расщепления фактора VIII, как он определен выше, или одной из его фармацевтически приемлемых солей замещения, включенной в фармацевтически приемлемый наполнитель, растворитель или носитель.

Эти фармацевтические композиции могут вводиться, например, трансбуккальным, ректальным, парентеральным, трансдермальным, окулярным, назальным или ушным путем.

Эти фармацевтические композиции могут быть твердым веществом или жидкостью и могут быть представлены в фармацевтических формах, используемых обычно в медицине человека, – таких, как, например, простые таблетки или таблетки с покрытием, желатиновые капсулы, гранулы, свечи, препараты для инъекции, трансдермальные системы (для введения через кожу), глазные капли, аэрозоли и распыляемые растворы, а также ушные капли. Их готовят обычным путем. Активное начало, состоящее из фармацевтически эффективного количества по меньшей мере одного из ингибиторов расщепления фактора VIII, как они определены выше, или одной из его фармацевтически приемлемых солей замещения, может быть включено сюда вместе с используемыми обычно в фармацевтических композициях наполнителями – такими, как тальк, гуммиарабик, лактоза, крахмал, стеарат магния, поливидон, производные целлюлозы, кокосовое масло, полусинтетические глицериды, водные или неводные носители, жиры животного или растительного происхождения, гликоли, различные увлажняющие агенты, диспергаторы или эмульгаторы, силиконовые гели, некоторые полимеры или сополимеры, консерванты, ароматизаторы и красители. Предпочтительной фармацевтической формой является форма для инъекции.

Настоящее изобретение распространяется также на фармацевтическую композицию с нейтрализующей активностью, которая может использоваться главным образом как подходящее лекарство для лечения таких заболеваний, как гемофилия А с продукцией алло-антител к фактору VIII; аутоиммунные заболевания с алло-антителами к фактору VIII (в случае, когда у этих пациентов обнаружены каталитические антитела), причем для указанной фармацевтической композиции характерно, что она содержит фармацевтически эффективное количество по меньшей мере одного указанного выше ингибитора расщепления фактора VIII или одной из его фармацевтически приемлемых солей замещения, включенной в фармацевтически приемлемый наполнитель, растворитель или носитель.

Изобретение распространяется также на способ терапевтического воздействия на млекопитающее, страдающего патологией, являющейся результатом уровня содержания в его крови фактора VIII, отличающийся тем, что указанному млекопитающему вводится терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного ингибитора расщепления фактора VIII, как он определен выше, или одной из его фармацевтически приемлемых солей замещения.

Этот способ обеспечивает главным образом успешное лечение заболеваний гемофилической природы, в особенности патологий, вызванных недостатком фактора VIII в крови больного.

Изобретение распространяется также на фармацевтическую композицию с противотромбозной активностью, которая может быть использована главным образом как полезное лекарство при таких заболеваниях как, в особенности, тромбоз, причем для указанной фармацевтической композиции характерно, что она содержит фармацевтически эффективное количество по меньшей мере одного типа алло-антител к фактору VIII, способных расщеплять фактор VIII, в особенности такого, какой может быть получен в процессе описанного выше способа, или одной из его фармацевтически приемлемых солей замещения, включенной в фармацевтически приемлемый наполнитель, растворитель или носитель.

Изобретение распространяется также на способ терапевтического воздействия на млекопитающих, для которого характерно то, что указанному млекопитающему вводят терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного типа алло-антител к фактору VIII, как они определены выше, или одной из его фармацевтически приемлемых солей замещения.

Этот способ обеспечивает главным образом успешное лечение заболеваний тромбозной природы, в особенности патологий, вызванных присутствием избытка фактора VIII в крови больного.

В терапии человека и животных алло-антитела к фактору VIII или ингибиторы расщепления фактора VIII, как они определены выше, могут вводиться сами по себе или в соединении с физиологически активным наполнителем, в любой форме, в частности, орально в форме желатиновых капсул или таблеток или парентерально в форме растворов для инъекций. Можно рассматривать другие формы введения – такие, как препараты в виде свечей, мазей, кремов, гелей или аэрозолей.

В контексте настоящего изобретения использованы следующие термины:

каталитические алло-антитела к фактору VIII, который понимается как обозначающий антитела, нацеленные на фактор VIII, наделенные каталитической активностью, индуцируемые у пациентов с гемофилией А при трансфузии терапевтических препаратов фактора VIII;

фактор VIII, который понимается как обозначающий кофермент фактора IX в ферментативном расщеплении фактора Х в процессе свертывания крови;

расщепление фактора VIII, который понимается как обозначающий создание фрагментов фактора VIII, которые не появляются вследствие спонтанного гидролиза или гидролиза физиологически расщепляющими ферментами – например тромбином, активированным фактором IX, активированным фактором Х и активированным белком С;

ингибитор расщепления фактора VIII, катализируемый алло-антителами к фактору VIII, который понимается как обозначающий любой пептид, принадлежащий или не принадлежащий к аминокислотной последовательности фактора VIII, или ингибитор протеазы, который способен специфически нейтрализовать гидролизующую активность каталитических антител к фактору VIII.

ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНОГО ВАРИАНТА ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В рекомбинантный фактор VIII человека была введена радиоактивная метка ¹²⁵I. Алло-антитела к фактору VIII были выделены и очищены из плазмы трех пациентов с гемофилией и ингибированием с помощью аффинной хроматографии на сефарозе (Sepharose), к матриксу которой был пришит очищенный иммунологическим методом фактор VIII человека. Аффинно очищенные антитела к фактору VIII пациентов Bor, Che и Wal ингибировали прокоагулянтную активность фактора VIII до уровня соответственно 57,0, 64,0 и 43,0 BU/мг (единиц Bethesda на мг) IgG.

Совместная инкубация меченого фактора VIII с алло-антителами к фактору VIII приводила, у двух пациентов из троих, к протеолизу молекулы. Была продемонстрирована специфичность гидролиза в сайтах объединения антител для алло-антител изотипа IgG к фактору VIII. Совместная инкубация [¹²⁵I]-фактора VIII с аффинно очищенным IgG к фактору VIII пациентов Bor и Wal в присутствии ингибиторов протеазы апротинина (0,15 мкМ), Е-64 (28 мкМ), EDTA (1,3 мкМ), лейпептина (10 мкМ) и пепстатина (10 мкМ) не приводила к ингибированию протеолитической активности.

Заявители охарактеризовали главные сайты расщепления каталитическим IgG в молекуле фактора VIII как следующие: Arg³⁷²-Ser³⁷³, находящийся между доменами А1 и А2 фактора VIII, Tyr¹⁶⁸⁰-Asp¹⁶⁸¹, находящийся на N-конце домена A3, и Glu¹⁷⁹⁴-Asp¹⁷⁹⁵, находящийся внутри домена A3.

Была продемонстрирована зависимость гидролиза фактора VIII алло-анителами к фактору VIII от времени и дозы. В частности, гидролиз наблюдался в условиях, когда IgG к фактору VIII и фактор VIII инкубировали совместно при молярных соотношениях, которые были в 80-9500 раз ниже, чем те, которые ожидались в плазме пациентов, что приводит к предположению, что гидролиз является механизмом инактивации фактора VIII алло-антителами пациентов in vivo.

Далее заявители исследовали кинетику опосредованного антителами гидролиза фактора VIII, инкубируя IgG к фактору VIII пациента Wal с возрастающими концентрациями немеченого фактора VIII в присутствии фиксированной концентрации [¹²⁵I]-фактора VIII. Кривые зависимости величины, обратной скорости, от величины, обратной концентрации субстрата, были линейными (r=0,99), что позволяет предположить, что реакция имеет простую кинетику Михаэлиса-Ментен, как уже наблюдалось для поликлональных каталитических антител. Для пациента Wal были рассчитаны кажущаяся каталитическая эффективность, V_max и скорость гидролиза алло-антителами к фактору VIII. На основании рассчитанных кинетических параметров гидролиза in vitro было сделано предположение, что механизмом инактивации фактора VIII алло-антителами пациентов in vivo может быть протеолиз.

Ассоциация фактора VIII с фактором фон Виллебранда (vWF) повышает каталитическую скорость тромбина по отношению к фактору VIII, поскольку он защищает фактор VIII от гидролиза активированным белком С (АРС). Добавление vWF к фактору VIII приводило к частичному ингибированию (т.е. на 36,9%) гидролиза фактора VIII иммуноглобулином G (IgG) к фактору VIII, если очищенный vWF и фактор VIII смешивали в весовом соотношении, близком к их соотношению в нормальной плазме, т.е. 30 мкг/мл vWF и 300 нг/мл фактора VIII.

Идентификация алло-антител к фактору VIII как каталитических антител, в добавление к описанным ранее гидролизующим антителам к вазоактивному кишечному пептиду (VIP) у пациентов с астмой, гидролизующим ДНК антителам у пациентов с системной красной волчанкой и тироглобулин-специфичным каталитическим антителам у пациентов с аутоиммунным тиреоидитом, расширяет спектр каталитических иммунных ответов. Насколько известно заявителям, это первое свидетельство индукции у человека каталитических антител в ответ на экзогенное введение белкового антигена. Кинетические параметры гидролиза фактора VIII проявляющим каталитические свойства IgG к фактору VIII и оценка количеств этих антител в плазме позволяют предположить наличие у каталитического иммунного ответа функциональной роли в инактивации фактора VIII in vivo. В поликлональной смеси алло-антител к фактору VIII, различающихся по их функциональным свойствам, каталитические антитела могут ингибировать прокоагулянтную активность фактора VIII с большей скоростью, чем некатализирующие антитела к фактору VIII. Таким образом, идентификация пептидных эпитопов, являющихся мишенями для протеолитических антител к фактору VIII, может быть решающей для понимания патофизиологии ответа с наличием ингибитора фактора VIII. Кроме того, получение характеристик ингибиторов фактора VIII как сайт-специфических протеаз обеспечивает новые подходы к лечению пациентов, имеющих алло-антитела к фактору VIII.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Для лучшего понимания настоящего изобретения и более ясного представления о его целях, характерных особенностях и преимуществах приведено нижеследующее объяснительное описание со ссылками на приложенные чертежи, которые даны исключительно как неограничивающие примеры, иллюстрирующие специфичность расщепления фактора VIII алло-анителами к фактору VIII.

Фиг.1: Гидролиз [¹²⁵I]-фактора VIII аффинно очищенными антителами IgG к фактору VIII пациентов с гемофилией А с ингибитором

Фиг.1 (А):

Меченый ¹²⁵I фактор VIII инкубировали с аффинно очищенным IgG к фактору VIII пациентов Bor (полоса Bor), Che (полоса Che) и Wal (полоса Wal) или только с буфером (полоса 1) в течение 10 ч при 38°С, затем проводили SDS-PAGE и авторадиографию. Для двух из троих пациентов (Bor и Wal) инкубация фактора VIII с аффинно очищенным IgG к фактору VIII приводила к гидролизу молекулы фактора VIII. Наоборот, профиль миграции в геле фактора VIII не изменялся, если меченый ¹²⁵I фактор VIII инкубировали с IgG к фактору VIII, очищенным из плазмы пациента Che (полоса Che). Профиль миграции фактора VIII не изменялся также и при инкубации с моноклональным IgG M061 человека к дигоксину (mAb) или с нормальным нефракционированным поликлональным IgG человека (Sandoglobulin®, IVIg), не проявляющим ингибирующей активности по отношению к фактору VIII (далее на чертежах обозначенному как F VIII).

Фиг.1 (В):

Фракции протока через аффинные колонки не содержали антител к фактору VII, определяемых методом твердофазного иммуноферментного анализа ELISA, и не гидролизовали меченый ¹²⁵I фактор VIII.

Фиг.1 (С):

Удаление IgG из кислотных элюатов, содержащих аффинно очищенные антитела к фактору VIII от пациентов Wal и Bor, хроматографией на белке G приводило к потере их гидролитической активности по отношению к фактору VIII.

Фиг.2: Гель-проникающая хроматография каталитической активности антител к фактору VIII

Фиг.2 (А):

Чтобы дополнительно исключить вероятность того, что протеолитическая активность антител обусловлена примесными протеазами, аффинно очищенные антитела к фактору VIII пациента Wal обрабатывали 8 М мочевиной и подвергали гель-проникающей хроматографии. Основной пик содержался во фракции 25, которая соответствует IgG по тесту ELISA. Гидролизующая активность элюировалась во фракции IgG, и таковая активность не обнаруживалась во фракциях, в которых отсутствовал IgG (например, фракция 35).

Фиг.2 (В):

Основной пик, выделенный во фракции 25, соответствовал IgG, как свидетельствует SDS-PAGE несущего радиоактивную метку содержимого фракции.

Фиг.3; Зависимость протеолиза [¹²⁵I]-фактора VIII аффинно очищенными антителами к фактору VIII пациентов с гемофилией А с ингибитором от дозы и от времени

Кинетика гидролиза фактора VIII алло-антителами к фактору VIII пациентов Bor и Wal. Скорость гидролиза меченого ¹²⁵I фактора VIII иммуноглобулином G к фактору VIII пациента Wal была выше, чем скорость гидролиза, проявляемая иммуноглобулином G к фактору VIII пациента Bor; это позволяет предположить, что каталитические антитела пациентов имеют различные кинетические свойства, или, альтернативно, что доля каталитических антител среди антител к фактору VIII у пациентов различается.

Фиг.4: Гидролиз [¹²⁵I]-фактора VIII антителами к фактору VIII в присутствии возрастающих количеств необработанного (немеченого) фактора VIII.

Кинетика опосредованного антителами гидролиза фактора VIII при инкубировании IgG к фактору VIII у пациента Wal с возрастанием концентрации немеченого фактора VIII в присутствии фиксированной концентрации [¹²⁵I]-фактора VIII. Добавление возрастающих концентраций количеств немеченого фактора VIII приводило к зависимому от дозы ингибированию гидролиза [¹²⁵I]-фактора VIII иммуноглобулином G (IgG) к фактору VIII. Насыщения гидролиза фактора VIII не было достигнуто при максимальной концентрации, которая была использована (т.е. при 1,7 мкМ). График зависимости величины, обратной скорости, от величины, обратной концентрации субстрата, был линейным (r=0,99), что свидетельствует о том, что реакция имеет простую кинетику Михаэлиса-Ментен, как уже наблюдалось для поликлональных каталитических антител.

Фиг.5: Ингибирование каталитической активности IgG к фактору VIII пациента Wal

Протеолиз несущего радиоактивную метку фактора VIII алло-антителами к фактору VIII пациента Wal подавлялся до приблизительно 62%, если антитела и фактор VIII совместно инкубировали в присутствии Pefabloc® (продукт фирмы Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany); это указывает на активность определенного ингибитора протеазы в нейтрализации каталитической активности некоторых из каталитических антител.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Аффинная очистка антител к фактору VIII

Антитела выделяли из плазмы осаждением сульфатом аммония. Затем антитела, реагирующие с фактором VIII, очищали аффинной хроматографией на матрице активированной CNBr сефарозы 4В, к которой был пришит очищенный иммунологическим методом промышленно выпускаемый фактор VIII, полученный из плазмы человека (25000 ед/3 г геля). Собирали фракции протока через колонку. После тщательной промывки фосфатно-буферным солевым раствором (PBS) рН 7,4 антитела к фактору VIII элюировали раствором 0,2 М глицина рН 2,8, диализовали против PBS и концентрировали с помощью Centripep. Отбирали пробы из фракций протока и элюатов и хранили их до использования при -20°С. Фрагменты F(ab)₂ антител к фактору VIII получали, как описано ранее.

Содержание IgG к фактору VIII в 10 мг IgG, нанесенного на колонку, для пациентов Bor, Che и Wal было равно соответственно 130, 20 и 280 мкг (то есть 143±130 мкг/мл нефракционированной плазмы), что согласуется с предшествующими наблюдениями.

Пример 2: Нейтрализующая активность по отношению к фактору VIII

Нейтрализующая активность по отношению к фактору VIII антител к фактору VIII определяли методом Kasper и др. и выражали в единицах Bethesda (BU). BU определяли как величину, обратную концентрации IgG, дающей 50% ингибирование про-коагулянтной активности фактора VII. Остаточную активность фактора VIII измеряли в одноступенчатом анализе путем измерения времени активированного частичного тромбопластина, используя в качестве субстрата лишенную фактора VIII человеческую плазму (Behring), а в качестве активатора – pathromptin® плаценты человека (Behring). Испытуемые прогретую плазму или иммунологически очищенный IgG к фактору VIII инкубировали с объединенной, обработанной цитратом человеческой плазмой в течение 2 ч при 37°С. Время свертывания для четырех последовательных разведений референсного образца плазмы (Immuno AG, Wien) сравнивали со временем свертывания трех разведений каждого испытуемого образца. Разведения делали в буфере Owren-Koller (Diagnostiga Stago), Расхождения между повторами составляли от 1 до 2,5%.

Аффинно очищенные антитела к фактору VIII пациентов Bor, Che и Wal ингибировали про-коагулянтную активность фактора VIII соответственно до 57,0, 64,0 и 43,0 BU/мг IgG.

Пример 3: Оценка гидролиза фактора VIII

Промышленно выпускаемый рекомбинантный фактор VIII человека метили ¹²⁵I иодогенным методом до удельной активности 11,6 нКюри/мкг. [¹²⁵I]-фактор VIII (от 1,5 до 150 нг) инкубировали в 50 мкл буфера 50 мМ трис-HCl рН 7,7, 100 мМ глицин, 0,025% твин-20 и 0,02% NaN₃ без или с добавлением от 17 до 1667 нМ иммунологически очищенного IgG к фактору VIII в течение от 5 мин до 10 ч при 38°С. Моноклональный IgG M061 человека к дигоксину (mAb) и нормальный нефракционированный человеческий поликлональный IgG (IVIg, Sandoglobulin®) использовали в качестве негативных контролей. Пробы смешивали в отношении 1:1 с буфером Лэмли без меркаптоэтанола и после нанесения в ячейки 20 мкл каждой пробы подвергали их без кипячения электрофорезу в присутствии SDS. Электрофорез проводили параллельно в 7,5% и 15% гелях с SDS при невосстанавливающих условиях. Электрофорез проводили при комнатной температуре с помощью системы mini-PROTEAN II при 25 мА/гель до достижения фронтом красителя низа геля. Затем гели сушили и зоны белка проявляли с помощью Х-ОМАТ AR. После авторадиографии сканировали зоны фактора VIII с кажущимся молекулярным весом 200 и 300 кДа, которые всегда гидролизуются IgG к фактору VIII, чтобы иметь возможность рассчитать скорость гидролиза меченого фактора VIII.

Пример 4: Быстрая гель-фильтрационная жидкостная хроматография белка

Аликвоту 100 мкл IgG к фактору VIII пациента Wal (740 мкг), обработанную 8М мочевиной, подвергали гель-фильтрации на колонке с суперозой-12, уравновешенной PBS с 0,01% азида, при скорости протока 0,2 мл/мин. Собирали фракции объемом 500 мкл и после 10-кратного разбавления анализировали их на наличие IgG методом ELISA-сэндвич и на протеолитическую активность по отношению к фактору VIII. Белки во фракции 25 метили ¹²⁵I и подвергали SDS-PAGE при невосстанавливающих условиях параллельно с нормальным поликлональным IgG человека. Гель окрашивали красителем кумасси голубым, а также авторадиографировали; затем оба изображения совмещали. Основной пик, выделенный во фракции 25, соответствовал IgG, согласно ELISA и SDS-PAGE меченого содержимого фракции. Гидролизующая активность элюировалась совместно с фракцией IgG и не обнаруживалась во фракциях, в которых отсутствовал IgG (например, фракция 35).

Пример 5. Анализ последовательностей NH₂-конца

Сахарозный состав с немеченым рекомбинантным фактором VIII (rDNA-ВНК) (300 мкг, octocog alfa, Bayer Corporation, Berkeley, CA, США) обрабатывали IgG к фактору VIII пациента Wal (74 мкг) в 1500 мкл буфера 50 мМ трис-HCl рН 7,7, 100 мМ глицин, 0,025% твин-20 и 0,02% NaN₃ в течение 24 ч при 38°С. Полученные фрагменты фактора VIII подвергали SDS-PAGE в 10% геле при 50 мА в невосстанавливающих условиях и переносили в течение 2 ч при 100 мА на мембрану Hybond-P PVDF (Amersham, Little Chalfont, Англия) в 10 мМ CAPS и 10% этаноле при рН 11,0. После окрашивания кумасси голубым видимые зоны вырезали и проводили N-концевое секвенирование с помощью автоматического белкового микросеквенатора Prosize 492 cLC (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Количество секвенированного белка, в зависимости от фрагмента, варьировало от 0,5 до 2 пикомолей.

Основными доступными для расщепления связями были следующие:

Arg³⁷²-Ser³⁷³ (R³⁷²-S³⁷³), находящаяся между доменами А1 и А2 фактора VIII, Tyr¹⁶⁸⁰-Asp¹⁶⁸¹ (Y¹⁶⁸⁰-D¹⁶⁸¹), находящаяся на N-конце домена A3, и Glu¹⁷⁹⁴-Asp¹⁷⁹⁵ (Е¹⁷⁹⁴–¹⁷⁹⁵), находящаяся внутри домена A3. Несколько сайтов расщепления фактора VIII антителами к фактору VIII могут иметь происхождение от индивидуальных антител с полиспецифической каталитической активностью или же поликлональных популяций антител, каждый тип из которых имеет уникальную специфичность в смысле сайта расщепления.

Пример 6: Исследование ингибирования проведено с помощью Pefabloc® – общего ингибитора сериновых протеаз

Гидролиз [¹²⁵I]-фактора VIII аффинно очищенными антителами IgG к фактору VIII пациентов с гемофилией А с ингибитором в присутствии Pefabloc®. [¹²⁵I]-фактор VIII (150 нг) инкубировали отдельно, в присутствии 50 мкг/мл иммунологически очищенного IgG к фактору VIII пациента Wal или в присутствии и IgG к фактору VIII, и ингибитора сериновых протеаз Pefabloc® (Boehringer) в течение 5 ч при 38°С. Затем фактор VIII анализировали с помощью SDS-PAGE в 7,5% геле при невосстанавливающих условиях. После авторадиографии зоны фактора VIII с кажущимся молекулярным весом 200 и 300 кДа, неизменно гидролизуемые IgG к фактору VIII, сканировали, чтобы вычислить процент гидролиза меченого фактора VIII.

Протеолиз радиоактивно меченого фактора VIII алло-антителами к фактору VIII пациента Wal был ингибирован до уровня приблизительно 62% в том случае, когда антитела и фактор VIII инкубировали совместно в присутствии Pefabloc®, что указывало на способность некоего ингибитора сериновых протеаз нейтрализовать каталитическую активность некоторых каталитических антител.

Дальнейшие наблюдения

При скрининге очищенных IgG от десяти имеющих высокий иммунный ответ пациентов с гемофилией А, при использовании в качестве молекулы-мишени меченого ¹²⁵I фактора VIII, для шести пациентов наблюдали изменения в профиле миграции фактора VIII. Эти результаты подкрепляют предыдущие наблюдения заявителей и указывают на то, что каталитические антитела к фактору VIII имеются приблизительно у 60% пациентов.

Формула изобретения

1. Способ определения наличия у млекопитающего аллоантител к фактору VIII, способных расщеплять фактор VIII, отличающийся тем, что он включает

i) выделение плазмы из образца крови, взятого у млекопитающего;

ii) выделение из плазмы аллоантител к фактору VIII;

iii) приведение аллоантител к фактору VIII в контакт с фактором VIII на период времени, достаточный для обеспечения расщепления фактора VIII аллоантителами к фактору VIII; и

iv) определение после периода времени, эффективно ли аллоантитела к фактору VIII расщепили фактор VIII.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что на этапе (i) аллоантитела к фактору VIII выделяют из плазмы, объединяя их с фактором VIII, причем фактор VIII предпочтительно связан с матриксом.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что на этапе (ii) аллоантитела к фактору VIII выделяют с помощью аффинной хроматографии.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что на этапе (ii) аффинная хроматография включает использование фактора VIII, ковалентно связанного с матриксом сефарозы, предпочтительно активированным цианоген-бромидом.

5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что на этапе (iii) фактор VIII помечен метящим агентом, предпочтительно радиоактивнометящим агентом, в частности, таким как ¹²⁵I.

6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что на этапе (iii) фактор VIII приводят в контакт с аллоантителами к фактору VIII на период времени от приблизительно 0,5 ч до приблизительно 30 ч, предпочтительно около 10 ч, при температуре от приблизительно 15°С до приблизительно 40°С, предпочтительно 38°С.

7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что этап (iv) проводят путем определения, включающего метод разделения, такой, как электрофорез в геле, в частности электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE), или гель-фильтрацию, в частности, такую, как быстрая жидкостная гель-фильтрационная хроматография белков, и технику визуализации, в частности, такую, как авторадиография.

8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что он дополнительно включает

v) получение характеристик сайта (сайтов) молекулы фактора VIII, в котором (которых) происходит расщепление аллоантителами к фактору VIII.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что получение характеристик осуществляют, приводя фактор VIII в контакт с аллоантителами к фактору VIII, способными расщеплять фактор VIII, разделяя и затем секвенируя полученные вследствие такой процедуры фрагменты фактора VIII.

10. Способ по п.8 или 9, отличающийся тем, что разделение проводят, используя такую технику, как электрофорез в геле, в частности, такую, как SDS-PAGE.

11. Способ по любому из пп.8-10, отличающийся тем, что секвенирование осуществляют, используя такую технику, как N-концевое секвенирование, в частности, с использованием автоматического белкового микросеквенатора.

12. Способ по любому из пп.8-11, отличающийся тем, что секвенирование следующим образом локализует способные к расщеплению связи: Arg³⁷²-Ser³⁷³, находящаяся между доменами А1 и А2, Tyr¹⁶⁸⁰-Asp¹⁶⁸¹, находящаяся на N-конце домена A3, и Glu¹⁷⁹⁴-Asp¹⁷⁹⁵, находящаяся внутри домена A3 молекулы фактора VIII.

13. Аминокислотная последовательность Ser Val Ala Lys Lys His Pro, способная ингибировать любой сайт в молекуле фактора VIII, чувствительный к лизису аллоантителами к фактору VIII.

14. Аминокислотная последовательность Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser, способная ингибировать любой сайт в молекуле фактора VIII, чувствительный к лизису аллоантителами к фактору VIII.

15. Аминокислотная последовательность Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu, способная ингибировать любой сайт в молекуле фактора VIII, чувствительный к лизису аллоантителами к фактору VIII.

16. Пептидный или непептидный аналог аминокислотной последовательности по любому из пп.13-15, отличающийся тем, что он способен ингибировать любой сайт в молекуле фактора VIII, который чувствителен к лизису аллоантителами к фактору VIII.

17. Применение ингибитора расщепления фактора VIII, катализируемого аллоантителами к фактору VIII в качестве вещества, нейтрализующего каталитические аллоантитела к фактору VIII.

18. Применение по п.17, отличающееся тем, что ингибитор содержит ингибитор протеаз, в частности, такой, как 4-(2-аминоэтил)бензилсульфонилфторид-гидрохлорид.

19. Применение по п.17 или 18, отличающееся тем, что ингибитор ингибирует расщепление способных к расщеплению связей: Arg³⁷²-Ser³⁷³, находящейся между доменами А1 и А2, Tyr¹⁶⁸⁰-Asp¹⁶⁸¹, находящейся на N-конце домена A3, и Glu¹⁷⁹⁴-Asp¹⁷⁹⁵, находящейся внутри домена A3 молекулы фактора VIII.

20. Применение по любому из пп.17-19, отличающееся тем, что ингибитор включает пептидный или непептидный аналог аминокислотной последовательности Ser Val Ala Lys Lys His Pro.

21. Применение по любому из пп.17-19, отличающееся тем, что ингибитор включает пептидный или непептидный аналог аминокислотной последовательности Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser.

22. Применение по любому из пп.17-19, отличающееся тем, что ингибитор включает пептидный или непептидный аналог аминокислотной последовательности Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu.

23. Фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что она содержит фармацевтически эффективное количество аллоантител к фактору VIII, способных расщеплять фактор VIII, получаемых при осуществлении способа по любому из пп.1-6.

24. Способ лечения млекопитающего, страдающего патологией, являющейся результатом ненормального уровня содержания фактора VIII в его крови, включающий введение указанному млекопитающему фармацевтической композиции, включающей в качестве активного компонента аллоантитела к фактору VIII, способные расщеплять фактор VIII.

25. Способ по п.24, отличающийся тем, что указанная патология является результатом наличия избытка фактора VIII в его крови.

26. Способ по п.24 или 25, отличающийся тем, что указанная патология представляет собой заболевание тромбозной природы, в частности, такое, как тромбоз.

27. Фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что она содержит фармацевтически эффективное количество аналога аминокислотной последовательности, как он определен в п.16.

28. Способ лечения млекопитающего, страдающего патологией, являющейся результатом субфизиологического уровня содержания фактора VIII в его крови, включающий введение указанному млекопитающему фармацевтической композиции, включающей в качестве активного компонента ингибитор расщепления фактора VIII.

29. Способ по п.28, отличающийся тем, что ингибитор содержит ингибитор протеаз, в частности, такой, как 4-(2-аминоэтил)бензилсульфонилфторид-гидрохлорид.

30. Способ по п.28 или 29, отличающийся тем, что ингибитор ингибирует расщепление способных к расщеплению связей: Arg³⁷²-Ser³⁷³, находящейся между доменами А1 и А2, Tyr¹⁶⁸⁰-Asp¹⁶⁸¹, находящейся на N-конце домена A3, и Glu¹⁷⁹⁴-Asp¹⁷⁹⁵, находящейся внутри домена A3 молекулы фактора VIII.

31. Способ по любому из пп.28-30, отличающийся тем, что ингибитор включает пептидный или непептидный аналог аминокислотной последовательности Ser Val Ala Lys Lys His Pro.

32. Способ по любому из пп.28-30, отличающийся тем, что ингибитор включает пептидный или непептидный аналог аминокислотной последовательности Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser.

33. Способ по любому из пп.28-30, отличающийся тем, что ингибитор включает пептидный или непептидный аналог аминокислотной последовательности Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu.

34. Способ по любому из пп.28-33, отличающийся тем, что патология представляет собой заболевание гемофилической природы, в частности заболевание, связанное с дефектами свертывания крови вследствие недостаточности фактора VIII, в особенности такое, как гемофилия А.

35. Ингибитор расщепления фактора VIII, катализируемого аллоантителами к фактору VIII, отличающийся тем, что он включает пептидный или непептидный аналог аминокислотной последовательности Ser Val Ala Lys Lys His Pro.

36. Ингибитор расщепления фактора VIII, катализируемого аллоантителами к фактору VIII, отличающийся тем, что он включает пептидный или непептидный аналог аминокислотной последовательности Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser.

37. Ингибитор расщепления фактора VIII, катализируемого аллоантителами к фактору VIII, отличающийся тем, что он включает пептидный или непептидный аналог аминокислотной последовательности Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu.

38. Фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что она содержит в качестве активного компонента фармацевтически эффективное количество ингибитора расщепления фактора VIII, катализируемого аллоантителами к фактору VIII.

39. Фармацевтическая композиция по п.38, отличающаяся тем, что указанный ингибитор содержит ингибитор протеаз, в частности, такой, как 4-(2-аминоэтил)бензилсульфонилфторид-гидрохлорид.

40. Фармацевтическая композиция по п.38 или 39, отличающаяся тем, что ингибитор ингибирует расщепление способных к расщеплению связей: Агд³⁷²-Ser³⁷³, находящейся между доменами А1 и А2, Tyr¹⁶⁸⁰-Азр¹⁶⁸¹, находящейся на N-конце домена A3, и Glu¹⁷⁹⁴-Asp¹⁷⁹⁵, находящейся внутри домена A3 молекулы фактора VIII.

41. Фармацевтическая композиция по любому из пп.38-40, отличающаяся тем, что она включает пептидный или непептидный аналог аминокислотной последовательности Ser Val Ala Lys Lys His Pro.

42. Фармацевтическая композиция по любому из пп.38-40, отличающаяся тем, что она включает пептидный или непептидный аналог аминокислотной последовательности Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser.

43. Фармацевтическая композиция по любому из пп.38-40, отличающаяся тем, что она включает пептидный или непептидный аналог аминокислотной последовательности Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu.

44. Аллоантитело к фактору VIII, отличающееся тем, что оно способно катализировать расщепление фактора VIII.

45. Аллоантитело к фактору VIII по п.44, отличающееся тем, что оно расщепляет способные к расщеплению связи в молекуле фактора VIII: Агд³⁷²-Ser³⁷³, находящуюся между доменами А1 и А2, Tyr¹⁶⁸⁰-Asp¹⁶⁸¹, находящуюся на N-конце домена A3, и Glu¹⁷⁹⁴-Asp¹⁷⁹⁵, находящуюся внутри домена A3 молекулы фактора VIII.

46. Аллоантитело к фактору VIII, наличие которого может быть определено способом, как он заявлен в любом из пп.1-12.

47. Аллоантитело к фактору VIII по п.46, отличающееся тем, что оно расщепляет способные к расщеплению связи в молекуле фактора VIII: Агд³⁷²-Ser³⁷³, находящуюся между доменами А1 и А2, Tyr¹⁶⁸⁰-Asp¹⁶⁸¹, находящуюся на N-конце домена A3, и Glu¹⁷⁹⁴-Asp¹⁷⁹⁵, находящуюся внутри домена A3 молекулы фактора VIII.

РИСУНКИ