Патент на изобретение №2258740

(54) СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ С ПОМОЩЬЮ ИЗОТЕРМИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ-RAMIL (РЕВЕРТАЗНОЕ АМПЛИФИКАЦИОННОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ (REVERTASE AMPLIFICATION ILLATION) ИЛИ РНК-аза H ЗАВИСИМОЕ АМПЛИФИКАЦИОННОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ (RNAase Н-DEPENDENT AMPLIFICATION ILLATION)

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано в молекулярно-генетической диагностике. Предложенный способ изотермической реакции амплификации предусматривает инкубирование в присутствии буферной системы одноцепочечной пробы исследуемой нуклеиновой кислоты с обратной транскриптазой M-MuLV или AMV с фрагментом Кленова (3′-5’ехо-) или без него, дезоксинуклеозидтрифосфатами и двумя парами специфических рибоолигонуклеотидных праймеров, где последовательность первой пары праймеров идентична 5′-концевой последовательности смысловой цепи исследуемой нуклеиновой кислоты, а последовательность второй пары праймеров комплементарна 3′-концевой последовательности смысловой цепи. Праймеры каждой пары различаются между собой наличием на 3′-конце одного из них дополнительных нуклеотидов. Применение изобретения позволяет удешевить детекцию микроорганизмов. 1 з.п. ф-лы, 1 ил.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к молекулярно-генетическим методам детекции микроорганизмов.

Одним из молекулярно-генетических методов детекции микроорганизмов является SDA (Strand Displacement Amplification) [1].

Амплификация с вытеснением цепи (SDA) использует свойство ДНК-полимеразы, лишенной экзонуклеазной активности синтезировать новую цепь ДНК, вытесняя рестрицированную цепь. Предварительно в ходе инициирования реакции с использованием специальных затравок создается сайт рестрикции для эндонуклеаз, например Hinc II. Поскольку в качестве предшественников в синтезе используются модифицированные дезоксинуклеозидтрифосфаты, такие как тиопроизводные аденозина (в случае использования эндонуклеазы рестрикции Hinc II) гидролиз рестриктазой Hinc II приводит к образованию насечки (гидролизуется одна цепь), в то время как вторая цепь остается нативной. SDA относится к классу изотермических реакций. Изотермические методы в отличие от ПЦР и ЛЦР позволяют отказаться от сложной и дорогостоящей аппаратуры и использовать в качестве инкубаторов лабораторные термостаты. Этот метод амплификации позволяет получить до 10⁶-10⁷ копий на одну используемую матрицу.

Цель изобретения – разработка нового молекулярно-генетического метода детекции микроорганизмов.

Предлагаемый метод детекции микроорганизмов отличается от метода SDA тем, что в качестве затравки используются 4 рибоолигонуклеотидных праймера, комплементарных к соответствующим последовательностям на противоположных цепях нуклеиновой кислоты: первые два (“А”, “В”) – комплементарные к участкам однонитевых фрагментов нуклеиновой кислоты, остальные два (“a”, “b”) – идентичные “А” или “В”, но имеющие дополнительные нуклеотиды в направлении 3′ (так называемые “3′ концевые участки”) также комплементарные к участкам однонитевых фрагментов нуклеиновой кислоты.

Рибоолигонуклеотиды “А” и “В” после отжига на ДНК матрицах (схема №1) и инициации синтеза новых цепей ДНК обратной транскриптазой M-MuLV или AMV с или без полимеразы фрагмент Кленова (3′-5′ ехо^–) удаляются от матриц в результате их расщепления РНК-азой Н, присутствующей в вышеперечисленных РНК зависимых ДНК полимеразах.

Рибоолигонуклеотиды “А” и “В” после отжига на РНК матрицах (схема 2) инициируют синтез новых цепей ДНК обратной транскриптазой M-MuLV или AMV. После элонгации ДНК матричные РНК разрушаются в результате их расщепления РНК-азой Н. Образующиеся в результате разрушения РНК-ДНК дуплексов однонитевые участки ДНК служат местом отжига для праймеров “В” и “А”. Обратная транскриптаза M-MuLV или AMV синтезирует новую цепь ДНК на матрице ДНК с одновременным вытеснением недорушенной матричной РНК в РНК-РНК дуплексе (праймер – РНК матрица) и окончательной достройкой ДНК на комплементарном рибоолигонуклеотидам “А” и “В” участке. Затем только вышеперечисленные праймеры будут субстратами для РНК-азы Н.

Образующиеся в результате разрушения РНК-ДНК дуплексов однонитевые участки ДНК служат местом отжига для копий ранее расщепленных праймеров, которые являются затравками для последующего синтеза ДНК с одновременным вытеснением ранее синтезированных благодаря отсутствию экзонуклеазных активностей на ДНК у вышеперечисленных полимераз.

После синтеза новых цепей вышеперечисленными полимеразами освобождаются ранее синтезированные цепи ДНК, которые служат матрицами для праймеров “В” и “А”.

Синтез новых цепей и последующее их вытеснение позволяет праймерам “а” и “b” гибридизироваться с ними так называемыми “З’ концевыми участками” и инициировать синтез ДНК, а также достроить обратной транскриптазе M-MuLV или AMV участок гибридизированной матрицы, комплементарный праймеру “А” в случае отжига праймера “а”, и комплементарного праймеру “В” после отжига праймера “b”.

Рибоолигонуклеотиды “а” и “b” после отжига и инициации синтеза новых цепей ДНК обратной транскриптазой M-MuLV или AMV с или без полимеразы фрагмент Кленова (3′-5′ ехо^–) также удаляются от матриц в результате их расщепления РНК-азой Н, присутствующей в вышеперечисленных РНК зависимых ДНК полимеразах.

Образующиеся в результате разрушения РНК-ДНК дуплексов однонитевые участки ДНК служат местом отжига для праймеров “А” и “В”, а также, но в гораздо меньшей степени, копий ранее расщепленных праймеров “а” и “b” (реакция проходит в изотермических условиях при температуре 37°С, более благоприятных для отжига праймеров “А” и “В”), которые являются затравками для последующего синтеза ДНК с одновременным вытеснением ранее синтезированных благодаря отсутствию экзонуклеазных активностей на ДНК у вышеперечисленных полимераз.

Такая стратегия позволяет проводить амплификацию ДНК в прогрессии, достаточной для последующей визуализации (из одной исследуемой мишени молекулы ДНК или РНК может амплифицироваться до 10¹¹ копий двухцепочечной ДНК с тупыми концами за 4-6 часов), причем образующиеся ампликоны идентифицируются в электрофореграммах как следующие фрагменты:

“)(” – амплифицированные двухцепочечные фрагменты ДНК с тупыми концами, ограниченные по 5′ концам последовательностями дезоксирибонуклеотидов, идентичными последовательностям рибонуклеотидов в так называемых “3′ концевых участках” рибоолигонуклеотидов “а” и “b”

“][” – не менее чем в 8 раз слабее сигнал (часто не видимый в электрофореграмме) по сравнению с “)(“, что связано с механизмом амплификации и короче “)(” на число ограниченных по 5′ концам последовательностям дезоксирибонуклеотидов, идентичных последовательностям рибонуклеотидов в так называемых “3′ концевых участках” рибоолигонуклеотидов “а” и “b”.

В процессе амплификации двухцепочечных фрагментов с тупыми концами “)(” и “][” нарабатываются так называемые “фоновые” фрагменты ДНК, обладающие разным размером ампликонов (недосинтезированные и не вытесненные цепи ДНК, недорушенные затравки на матрицах в момент непосредственного анализа).

Поэтому для детекции в RAMIL следует ориентироваться на самый яркий сигнал с заданной длиной ампликонов.

Условия проведения реакции.

Ревертазное амплификационное заключение (Revertase Amplificaton Illation) на примере детекции Chlamydia psittaci:

RAMIL выполняется в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 2 мкл охлажденной в ледяной бане, но предварительно денатурированной кипячением исследуемой пробы ДНК, подготовленной любым методом выделения нуклеиновых кислот для молекулярно-генетических исследований; 75 мкМ КС1, 50 мМ Tris-HCl (pH 8,3 при 25°С), 3 мМ MgCl₂, 10 мМ DTT, 200 мкМ dNTP, no 1 мкМ каждого из четырех рибоолигонуклеотидных праймеров (“А”, “В”, “а”, “b”), 5 единиц обратной транскриптазы M-MuLV или AMV.

Реакцию проводят при температуре 37°С в условиях термостата в течение 4-6 часов с последующей визуализацией амплифицированной ДНК методом гель электрофореза. Для этого продукты амплификации смешивают с буфером для нанесения проб (0,25% бромфенолового синего, 40% (вес-объем) сахарозы в Н₂О) в соотношении 6:1. Полученную смесь вносят в лунки 2% агарозного геля, приготовленного на ТАЕ буфере (0,04 М трис-ацетат, 0,002 М ЭДТА, pH 8,0) с содержанием бромистого этидия 0,5 мкг/мл и подвергают горизонтальному электрофорезу в ТАЕ буфере при напряжении 5 В/см в течение 1-1,5 часов с последующим просматриванием в УФ-трансиллюминаторе (290-330 нм).

РНК-аза В зависимое амплификационное заключение (RNase Н-dependent Amplificaton Illation) на примере детекции Chlamydia psittaci:

RAMIL выполняется в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 2 мкл охлажденной в ледяной бане, но предварительно денатурированной кипячением исследуемой пробы ДНК, подготовленной любым методом выделения нуклеиновых кислот для молекулярно-генетических исследований; 50 мкМ КС1, 20 мМ Tris-HCl (pH 7,8 при 25°С), 5 мМ MgCl₂, 7,5 мМ DTT, 200 мкМ dNTP, по 1 мкМ каждого из четырех рибоолигонуклеотидных праймеров (“А”, “В”, “а”, “b”), 2 единицы обратной транскриптазы M-MuLV или AMV, 5 единиц полимеразы фрагмент Кленова (3′-5′ exo^–).

Реакцию проводят при температуре 37°С в условиях термостата в течение 4-6 часов с последующей визуализацией амплифицированной ДНК методом гель электрофореза. Для этого продукты амплификации смешивают с буфером для нанесения проб (0,25% бромфенолового синего, 40% (вес-объем) сахарозы в Н₂О) в соотношении 6:1. Полученную смесь вносят в лунки 2% агарозного геля, приготовленного на ТАЕ буфере (0,04 М трис-ацетат, 0,002 М ЭДТА, pH 8,0) с содержанием бромистого этидия 0,5 мкг/мл и подвергают горизонтальному электрофорезу в ТАЕ буфере при напряжении 5 В/см в течение 1-1,5 часов с последующим просматриванием в УФ-трансиллюминаторе (290-330 нм).

Рибоолигонуклеотидные праймеры выбраны на основе анализа консервативного участка генома Chlamydia psittaci (СР. SEQ):

5′[(gcaagacactc)ctcaaagccat]taattgcctacaggatatcttgtctggctttaacttgg acgtggtgccgccagaagagcaaattagaatagcgagcacaaaaagaaaagatactaagc ataatctttagaggtgagtatgaaaaaactcttgaaatcggcattattgtttgccgctac gggttccgctctctccttacaagccttgcctgtagggaacccagctgaaccaagtttattaat[cgatggcact(atgtgggaagg)]3′

CP. SEQ представляет собой последовательность длиной 264 пары нуклеотидов (п.н.), включившую в себя 139 п.н. из 5′-не транслируемого региона и 125 п.н. из транслируемого региона, кодирующего синтез первых 41-42 аминокислот большого белка наружной мембраны возбудителя.

Рибоолигонуклеотидный праймер “A” 5′(gcaagacacuc)3′ идентичен основаниям – 139-129 5’не транслируемого региона;

рибоолигонуклеотидный праймер “a” 5′[(gcaagacacuc)cucaaagccau]3′ идентичен основаниям – 139-118 5′ не транслируемого региона;

рибоолигонуклеотидный праймер “В” 5′ (ccuucccacau)3′ комплементарен к основаниям 115-125 транслируемого региона;

рибоолигонуклеотидный праймер “b” 5′ [(ccuucccacau)agugccaucg]3′ комплементарен к основаниям 105-125 транслируемого региона.

Результатом предлагаемого метода RAMIL со специфичными для Chlamydia psittaci рибоолигонуклеотидными праймерами “А”, “В”, “а”, “b” проб ДНК штаммов Chl. psittaci “КС-93”, “ПП-87”, “250” является амплификация специфичного фрагмента ДНК хламидий длиной 242 пар нуклеотидов (см. чертеж).

Источник информации

1. STRAND DISPLACEMENT AMPLIFICATION /Inventor – Walker/ United States Patent №5,455,166 / Date of Patent *Oct.3, 1995.

Формула изобретения

1. Способ детекции микроорганизмов с помощью изотермической реакции амплификации, включающий подготовку одноцепочечной пробы исследуемой нуклеиновой кислоты, внесение указанной пробы в реакционную смесь, состоящую из буферной системы, олигонуклеотидных праймеров, полимеразы и dNTP_S, инкубацию реакционной смеси при температуре 37°С в термостате в течение 4-6 ч и анализ продуктов реакции методом гель-электрофореза на предмет выявления специфичного для определенного микроорганизма амплифицированного фрагмента ДНК, отличающийся тем, что указанная изотермическая реакция амплификации является реакцией RAMIL, которая предусматривает, что в качестве полимеразы применяют обратную транскриптазу M-MuLV или AMV с фрагментом Кленова (3′-5’ехо-) или без него и используют четыре рибоолигонуклеотидных праймера “А”, “а” и “В”, “b”, где праймер “а” отличается от “А”, а праймер “b” – от “В” наличием дополнительных нуклеотидов на их 3′-конце, причем праймеры “А” и “а” идентичны 5′-концевой последовательности смысловой цепи исследуемой нуклеиновой кислоты, а “В” и “b” комплементарны ее 3′-концевой последовательности.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что детектируемым микроорганизмом является Chlamydia psittaci, а указанные праймеры имеют следующие нуклеотидные последовательности:

“А” – 5’gcaagacacuc3′;

“а” – 5’gcaagacacuccucaaagccau3′;

“В” – 5’ссuuсссасаu3′;

“b” – 5’ccuucccacauagugccaucg3′.

РИСУНКИ

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 22.08.2007

Извещение опубликовано: 10.03.2009 БИ: 07/2009