Патент на изобретение №2258221
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ТРОФОБЛАСТИЧЕСКОГО БЕТА-ГЛОБУЛИНА
(57) Реферат:
Изобретение относится к области медицины. Способ характеризуется тем, что в качестве исходного материала используют мочу беременных женщин поздних сроков, либо мочу беременных поздних сроков, больных гестозами. Солевое фракционирование белков проводят сульфатом аммония 40% насыщения, раствор экспонируют в течение 8-10 ч, затем центрифугируют при 7000 об/мин в течение 20-25 минут, а осадок, разведенный 0,15 М раствором хлорида натрия, обессоливают диализом против 0,025 М фосфатного буфера с рН 7,4. Изобретение обеспечивает упрощение способа, сокращение времени процесса получения препарата. 1 з.п. ф-лы, 1 ил.
Изобретение относится к области медицины, а именно к биохимии, и может быть использовано для получения чистого препарата трофобластического Недостатками известного способа являются: – многоэтапность, трудоемкость, сложность используемых методов; – высокая стоимость реагентов, дороговизна и малодоступность исходного материала (сыворотка крови); – инвазивный метод получения биоматериала; – наличие в исходном материале большого количества балластных белков. Известен также “Способ получения трофобластического Однако известный способ имеет следующие недостатки: – обязательная привязка к производственному процессу и вследствие этого территориальная ограниченность получения исходного биоматериала; – сложность, трудоемкость, длительность технологического процесса с учетом начальных этапов до образования осадка A1; – малодоступность применяемых сорбентов; – наличие в исходном материале большого количества балластных белков. Недостатками прототипа являются: – его техническая сложность, многоэтапность (длительность процесса очистки 6-7 суток), значительные трудозатраты; – дороговизна и малодоступность сорбентов и реактивов, необходимых для практической реализации данного способа; – необходимость большого количества исходного биоматериала за счет более низкой концентрации ТБГ в плаценте по сравнению с кровью. Целью предлагаемого способа является повышение эффективности способа и упрощение его. Поставленная цель в изобретении достигается тем, что в качестве исходного материала используют мочу беременных женщин поздних сроков, солевое фракционирование белков проводят сульфатом аммония 40% насыщения, раствор экспонируют в течение 8-10 ч, затем центрифугируют при 7000 об/мин в течение 20-25 минут, а осадок, разведенный 0,15 М раствором хлорида натрия, обессоливают диализом против 0,025 М фосфатного буфера с рН 7,4. В качестве исходного биоматериала используют мочу беременных женщин поздних сроков, больных гестозами. Предлагаемый способ основан на том, что число белковых компонентов мочи беременных женщин поздних сроков значительно меньше таковых в сыворотке крови и других биологических жидкостях, в то время как концентрация ТБГ относительно высока. Кроме того, авторами показано, что в моче беременных женщин с гестозами средняя концентрация ТБГ достоверно выше таковой в моче здоровых беременных женщин аналогичных сроков. Это объясняется повышенной порозностью почечного барьера при гестозах. Выявлены оптимальные параметры осаждающего реагента (40% от насыщающей концентрации сульфата аммония), обеспечивающие максимальный выход ТБГ практически без белковых примесей. В этих условиях альбумин и другие анодные белки, составляющие основную часть белков мочи беременных, остаются в надосадке. Величина экспозиции осаждения увеличена до 8-10 часов с целью более полного осаждения ТБГ из мочи. Разработаны оптимальные скорость (7000 об/мин) и время (20-25 мин) центрифугирования, обеспечивающие наиболее быструю и полную седиментацию ТБГ в минимальные сроки. 0,15 М раствор хлорида натрия выбран в качестве раствора разведения осадка ввиду доступности, изотоничности и хорошей сольватирующей способности. Для того чтобы полученный препарат в дальнейшем мог быть использован в работе с лабораторными животными, в качестве диализующего раствора выбран фосфатный буфер с физиологическим значением рН, ионным составом и отсутствием жестких анионов. Подобрана оптимальная ионная сила диализующего буферного раствора (0,025 моль/л), обеспечивающая максимальную скорость диализа при сохранении рН диализата. Следовательно, применение мочи беременных женщин в качестве исходного биоматериала, выделение и очистка ТБГ по разработанной схеме значительно упрощает и повышает эффективность процесса. Способ сокращается до одного основного этапа очистки (осаждение) и одного вспомогательного (диализ). Нами был разработан следующий алгоритм получения чистого препарата ТБГ: – фракционирование сульфатом аммония 40% насыщения; – диализ осадка против 0,025 М фосфатного буфера, рН 7,4. На первом этапе проводили фракционирование белков мочи раствором сернокислого аммония 40% насыщения. Раствор экспонировали в течение 8-10 часов. Полученный осадок разводили 0,15 М раствором хлорида натрия и диализовали против 0,025 М фосфатного буфера, рН 7,4, в течение ночи (не менее 2 л буферного раствора на 1 мл растворенного осадка). После каждого этапа предлагаемого способа проводили идентификацию ТБГ в полученных белковых фракциях методом иммунодиффузии в агаровом геле и контроль качества препарата методом иммуноэлектрофореза и электрофореза в ПААГ. Применение данного способа позволяет получать ТБГ высокой степени чистоты при минимальных трудовых и финансовых затратах. Предлагаемый способ был успешно апробирован в научной лаборатории кафедры биохимии Астраханской государственной медицинской академии в течение 2001-2002 гг. Ниже приводятся результаты апробации: Пример №1: 1-й этап: Осаждение сульфатом аммония. Исходным материалом служила сливная моча беременных женщин поздних сроков (36-40 недель). Использовали сухой, предварительно перекристаллизованный и хорошо измельченный порошок сернокислого аммония (ч.д.а.). Сухой порошок сульфата аммония добавляли в мочу беременных женщин малыми порциями при постоянном помешивании в количестве, соответствующем 40% от насыщающей концентрации (242 г/л). Перемешивание продолжали в течение 20-30 минут после растворения последней порции соли. Осаждение проводили в течение 8 часов при комнатной температуре. Затем раствор центрифугировали при 7000 об/мин в течение 20 минут. Осадок, содержащий ТБГ, растворяли в физиологическом растворе до объема, превышающего объем осадка не более чем в 2 раза. Полученные концентрированные белковые растворы хранились в холодильнике при -18°С. 2-й этап: диализ против 0.05 М фосфатного буфера рН 7.4. Белковый концентрат, полученный на предыдущем этапе, содержал значительное количество сульфата аммония, который удаляли диализом против 0,025 М фосфатного буфера, рН 7,4 (не менее 2л буферного раствора на 1 мл растворенного осадка), в течение ночи при комнатной температуре. Вывод: чистота полученного препарата ТБГ, определяемая методами иммуно диффузии с поливалентной антисывороткой на белки сыворотки крови беременных женщин и сравнительного электрофореза в полиакриламидном геле, оказалась высокой (см. чертеж, Пример №2 Получение препарата ТБГ проводили по методике примера №1, но со следующими отличиями: осаждение проводили в течение 10 часов, раствор центрифугировали течение 25 минут. Вывод: Средняя концентрация ТБГ в полученных фракциях составила 160±25 мг/л. Чистота полученного препарата ТБГ оказалась такой же высокой, как и в примере №1. Пример №3: Получение препарата ТБГ проводили по методике примера №1, но со следующими отличиями: осаждение проводили в течение 9 часов, раствор центрифугировали течение 22 минут. Вывод: Средняя концентрация ТБГ в полученных фракциях составила 164±28 мг/л. Чистота полученного препарата ТБГ оказалась такой же высокой, как и в примерах №1 и №2. Пример №4: Получение препарата ТБГ проводили по методике примера №3, но с той разницей, что в качестве исходного биоматериала брали мочу беременных женщин, больных гестозами. Вывод: Параметры и условия эксперимента в данном примере оказались оптимальными. Концентрация ТБГ в полученном препарате была еще выше, чем в примерах №1, №2 и №3 (245±16 мг/л), в то время как чистота полученного препарата ТБГ оказалась такой же высокой, как и в предыдущих примерах. Пример №5 Получение препарата ТБГ проводили по методике примера №1, но со следующим отличием: фракционирование белков мочи на первом этапе осуществлялось раствором сульфата аммония 25% насыщения. Вывод: ТБГ во фракциях отсутствовал в результате недостаточной концентрации осадителя для этого белка. Пример №6 Получение препарата ТБГ проводили по методике примера №1, но со следующим отличием: фракционирование белков мочи на первом этапе осуществлялось раствором сульфата аммония 60% насыщения. Вывод: Концентрация ТБГ в полученном белковом препарате была значительной, но не выше, чем в примерах № 1, №2 и №3. Однако чистота полученного препарата была неудовлетворительной. Объясняется это, очевидно, высокой высаливающей концентрацией сульфата аммония, в результате чего в осадке оказалась значительная часть балластных белков мочи. Предлагаемый способ имеет следующие преимущества: – технически прост, требует незначительных трудозатрат (для его применения достаточно 1 специалиста); – значительное сокращение времени, необходимого для осуществления полного процесса очистки, – 2 дня (в прототипе 6-7 дней); – дешевизна и доступность реактивов и вспомогательной аппаратуры, необходимых для практической реализации данного способа; – использование неинвазивным методом полученного исходного биоматериала и его экономическое преимущество. В дальнейшем полученный очищенный препарат ТБГ использовали, в частности, для получения моноспецифической антисыворотки на ТБГ путем иммунизации кроликов. Причем чистота полученного препарата ТБГ позволяла получить моновалентную антисыворотку на ТБГ, которая не требовала истощения. Полученная антисыворотка, в свою очередь, может быть использована для моделирования диагностической тест-системы на ТБГ.
Формула изобретения
1. Способ получения препарата трофобластического 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве исходного биоматериала используют мочу беременных женщин поздних сроков, больных гестозами.
РИСУНКИ
MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 11.04.2007
Извещение опубликовано: 27.02.2008 БИ: 06/2008
|
||||||||||||||||||||||||||
-глобулина (ТБГ).
– препарат ТБГ, выделенного из мочи;