Патент на изобретение №2258219

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ИМИПЕНЕМА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ У НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии и неонатологии, и касается способа определения концентрации имипенема в биологических жидкостях у новорожденных детей. Сущность изобретения заключается в использовании микробиологического метода диффузии в агаре с использованием тест-системы Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893), который культивируют в питательной среде, окружающей панкреатический гидролизат кильки, агар микробиологический, хлорид натрия и воду дистиллированную, взятые в определенных количествах. Преимущество изобретения заключается в повышении чувствительности способа. 1 табл.

Изобретение относится к области медицины, в частности, к педиатрии и неонатологии.

В основу работы положена идея разработки стандартных схем и индивидуального подбора антибиотикотерапии у новорожденных детей с тяжелой перинатальной патологией (сепсис, пневмония, развившаяся на фоне искусственной вентиляции легких у детей с синдромом дыхательных расстройств) на основании исследования концентрации антибиотика имипенема в крови и трахеобронхиальных аспиратах и расчета фармакокинетических параметров.

В последние годы в неонатологии для лечения тяжелых инфекционно-воспалительных заболеваний (сепсис, пневмония) у новорожденных детей стал применяться бета-лактамный антибиотик группы карбапенемов имипенем/циластатин натрия (тиенам). Это комбинированный препарат, представляющий собой сочетание имипенема и циластатина натрия в равных количествах. Имипенем является бета-лактамным антибиотиком с ультрашироким спектром действия, охватывающим грамположительные и грамотрицатель-ные аэробные и анаэробные микрорганизмы. Циластатин натрия – специфический ингибитор фермента дегидропептидазы 2, осуществляющей метаболизм имипенема в почках и в результате этого значительно повышающий его концентрацию в мочевыводящих путях. Циластатин натрия не обладает антибактериальным действием. Комбинированный препарат имипенем эффективен для лечения новорожденных детей с тяжелой госпитальной инфекцией, обусловленной бактериями, полирезистентными к другим антибиотикам [1, 2].

Опыт применения тиенама в неонатологии небольшой и касается только оценки его клинической и микробиологической эффективности. В инструкции к этому препарату отсутствуют рекомендации по его применению у новорожденных и недоношенных детей, что связано с продолжающимся накоплением опыта использования карбапенемов у этой категории детей. В настоящее время неонатологи, применяющие тиенам в отделениях реанимации и интенсивной терапии новорожденных, основываются на общих сведениях об особенностях фармакокинетики антибиотиков у новорожденных и применяют разовые дозы тиенама от 15 до 25 мг/кг (дозы действующего вещества антибиотика имипенема от 7,5 до 12,5 мг/кг) с интервалом 6 часов, увеличивая интервалы между введениями тиенама до 8-12 часов у глубоконедоношенных и детей первой недели жизни [2, 3, 4].

Вместе с тем, изучение фармакокинетики имипенема (антибактериального компонента препарата Тиенам) у новорожденных имеет важное значение при разработке тактики антибиотикотерапии. Концентрация антибиотиков в биологических жидкостях (кровь, моча, ликвор, желчь, синовиальная жидкость) и тканях организма, а также антимикробная активность препаратов относятся к основным параметрам, определяющим эффективность антибиотикотерапии. Результаты изучения особенностей распределения и выведения антибиотиков при их внутривенном введении являются основой для разработки схем лечения, обеспечивающих безопасность и терапевтический эффект препаратов.

Наиболее важными параметрами фармакокинетики антибиотика при внутривенном введении являются: величина его максимальной концентрации «С мах» в тканях, крови и других биожидкостях, период полувыведения «Т1/2» антибиотика, т.е. время, за которое его концентрация в плазме крови снижается вдвое; величина остаточной концентрации «Co», т.е. концентрация антибиотика в биожидкостях и тканях перед следующим введением, а также кажущийся объем распределения антибиотика «Vd», который показывает, какая часть препарата вышла из сосудистого русла в ткани.

На основании изучения фармакокинетики имипенема могут быть разработаны стандартные схемы его применения в составе комплексного препарата тиенам у новорожденных, рассчитанные на обычную неизмененную функцию органов, обеспечивающих выведение и метаболические превращения. Фармакокинетические показатели (прежде всего его концентрация в биожидкостях и тканях) в сопоставлении со значениями минимальной подавляющей концентрацией (МПК) антибиотика для выделенного возбудителя дают возможность обосновать индивидуальный план лечения новорожденного и прогнозировать эффективность этого лечения. При этом необходимо учитывать, что для обеспечения терапевтического эффекта при тяжелых заболеваниях необходимо поддержание концентрации имипенема в крови на уровне 2-4-кратных значений МПК. Как отмечают Зайцев А.А. и Карпов О.И. [5], анализ фармакокинетики имипенема у взрослых показал, что его бактерицидное действие зависит не столько от максимальной концентрации, а от времени поддержания уровня антибиотика в крови выше МПК для данного возбудителя. Поэтому более важной является кратность введения антибиотика и менее важной – разовая доза. В своем исследовании Richerson M.A. с со-авт. [6] показали, что бактерицидный эффект имипенема достигает максимума, если уровень его в плазме крови превышает МПК для возбудителя в течение 40% времени между повторными введениями препарата. У новорожденных детей с тяжелыми инфекционно-воспалительными заболеваниями (сепсис, пневмония), состояние которых оценивается как очень тяжелое или критическое, развивается полиорганная недостаточность с нарушением функции печени и почек [4]. У таких детей применение антибиотиков должно проводиться на основе индивидуального режима дозирования с учетом уровня креатинина в крови и его клиренса. Это позволит повысить эффективность антибиотикотерапии и предупредить развитие побочных реакций, опасность возникновения которых повышается в связи с нарушением основных механизмов выведения и метаболизма антибиотика.

В качестве прототипа предлагается способ определения концентрации бета-лактамных антибиотиков цефалоспоринового ряда в биологических жидкостях с использованием микробиолгического метода диффузии антибиотика в агар с применением одного слоя питательной среды [7].

От прототипа предлагаемый нами способ отличается тем, что был применен штамм Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) вместо штамма Bacillus subtillus ATCC 6633, так как последний обладает умеренной чувствительностью к имипенему (МПК=5 мкг/мл), что не обеспечивает достаточной чувствительности метода. Во многих случаях МПК имипенема в отношении возбудителей значительно меньше 5 мкг/мл. Поэтому использование Bacillus subtillus ATCC 6633 не дает возможности точно определить время, в течение которого концентрация антибиотика будет превышать МПК возбудителя. Приведенные выше обстоятельства требуют разработки новой методики определения концентрации имипенема в биожидкостях с подбором нового высокочувствительного тест-штамма и условий его культивирования с этим антибиотиком (разработка новой питательной среды и режима культивирования).

Технический результат изобретения. Предлагаемый нами способ имеет преимущество перед прототипом. Мы использовали более чувствительный тест-штамм Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) и специальную питательную среду нового состава для его культивирования. Это позволило определять более низкие концентрации имипенема (1 мкг/мл и ниже) в биологических жидкостях, в то время как метод, указанный в наиболее близком прототипе с использованием тест-штамма Bacillus subtillus ATCC 6633, позволяет определять концентрацию имипенема 5 мкг/мл и выше.

Цель изобретения: разработка нового способа определения концентрации имипенема в биологических жидкостях организма. Поставленная цель достигается путем использования микробиологического метода диффузии в агар с применением тест-штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) и питательной среды нового состава для его культивирования.

Описание способа определения концентрации имипенема в биологических жидкостях. Определение концентрации имипенема проводят по схеме, общей для всех антибиотиков [7].

1. Для культивирования тест-штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) была разработана оптимальная по составу и рН питательная среда, обеспечивающая максимальную диффузию растворов имипенема в среду и четкость очертания зон.

Состав питательной среды:

Питательную среду автоклавируют 30 мин при 0,5 атм, рН среды после автоклавирования – 7,2

2. Тест штамм: Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893). Посевная доза Bacillus IP 5832 (АТСС 14893) – 4 млн спор в 1 мл питательной среды.

3. Подготовка чашек Петри со средой и тест-микробом.

Определение концентрации имипенема в биологических субстратах проводят в одном слое питательной среды, разлитой в чашки Петри по 10 мл в каждую чашку. В предварительно охлажденный до 60°С питательный агар приведенного выше состава вносят взвесь спор тест-штамма из расчета 5 мл микробной взвеси на 95 мл среды. Взвесь спор готовят на физиологическом растворе в концентрации 80 млн спор в 1 мл. Эта взвесь может храниться при +4°С в течение двух недель. В застывшем агаре, содержащем тест-штамм, делают лунки диаметром 8 мм.

4. Приготовление рабочих растворов стандарта антибиотика имипенема для построения калибровочной кривой.

Для приготовления рабочих растворов стандарта антибиотика делают произвольную, но точную навеску на аналитических весах. Навеску растворяют в дистиллированной воде из расчета 1 мг в 1 мл (основной раствор). Дальнейшие разведения готовят путем разведения основного раствора в фосфатном буфере рН 7,2 до нужных концентраций: 0,125; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0 мкг/мл.

5. Приготовление биологического материала.

Для определения антибиотика в плазме крови, последнюю собирают в пробирку с раствором гепарина, встряхивают и центрифугируют при 700g 15 мин. Плазму отсасывают и делают разведения в физиологическом растворе 1:2, 1:5, 1:10, 1:20.

Для определения антибиотика в трахеобронхиальном аспирате, последний собирают через интубационную трубку при санировании дыхательных путей новорожденного, находящегося на искусственной вентиляции легких.

В эндотрахеальную трубку вводят 1 мл стерильного физиологического раствора и затем аспирируют содержимое дыхательных путей в пластиковый стерильный контейнер. Предварительно дважды промывают трахеобронхиальную трубку тем же количеством физиологического раствора.

Трахеобронхиальный аспират разбавляют физиологическим раствором 1:2, затем гомогенизируют в ручном стеклянном гомогенизаторе и центрифугируют в режиме 1000 g 15 минут. Полученный супернатант, представляющий собой растворимую фракцию трахеобронхиального секрета, разбавляют дополнительно физиологическим раствором 1:2, 1:4, 1:8 и 1:16 и используют для последующего определения концентрации антибиотика.

6. Постановка реакции.

Приготовленные растворы стандарта антибиотика и испытуемые растворы (нативная плазма крови и ее разведения, супернатант трахеобронхиального аспирата и его разведения) вносят в лунки агара с помощью пипетки в объеме 0,1 мл, чередуя стандартный и испытуемые растворы. Для каждого испытания используют не менее 3 чашек. Чашки инкубируют при 37°С в течение 18 часов.

7. Расчет активности испытуемого антибиотика имипенема.

Расчет активности испытуемого антибиотика в биожидкостях проводят по общепринятой стандартной схеме [7].

Концентрацию антибиотика в испытуемом субстрате определяют по стандартной калибровочной кривой. Для построения стандартной кривой используют 5 концентраций раствора стандартного препарата имипенема: 0,125; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0 мкг/мл.

Одна из концентраций, по которой вносят поправки, является контрольной (для имипенема установлена концентрация 0,5 мкг/мл). Для каждой концентрации, кроме контрольной, используют 3 чашки (всего 12 чашек). В 3 лунки каждой чашки вносят растворы контрольной концентрации, в 3 другие лунки – одну из взятых концентраций раствора. После измерения зон задержки роста для каждой концентрации выводят среднюю величину зоны на трех чашках, затем находят среднюю величину зоны для контрольной концентрации на всех чашках (12 чашек × 3 зоны=36 зон).

По разности между средней величиной зоны контрольной концентрации, выведенной на 12 чашках, и средней величиной зоны контрольной концентрации, определенной из 3 чашек с каждой отдельной концентрацией, находят поправку к величине зоны данной концентрации. Поправку прибавляют к средней величине зоны данной концентрации, если она положительная, и вычитают, если поправка отрицательная.

Стандартную кривую строят на полулогарифмической сетке по исправленным значениям величин зон взятых концентраций и средней величине зоны контрольной концентрации. По оси абсцисс откладывают диаметр зоны задержки роста тест-штамма, а по оси ординат – значения концентраций имипенема.

При определении концентрации антибиотика в биологических жидкостях в зависимости от количества субстрата используют одну или несколько чашек для этого субстрата и каждого его разведения. Параллельно с испытуемым материалом в лунку каждой чашки вносят контрольную концентрацию стандартного раствора. После инкубации при 37°С в течение 18 часов измеряют зоны задержки роста тест-микроба, образуемые контрольной концентрацией стандарта и испытуемым раствором. Разность между найденными средними величинами зон испытуемого образца и контрольной концентрации прибавляют к величине зоны контрольной концентрации на стандартной кривой. Затем по кривой находят концентрацию, соответствующую найденной величине зоны в мкг/мл. Полученную концентрацию умножают на степень разведения и, таким образом, определяют содержание имипенема в 1 мл испытуемого материала. Точность метода ±10%.

Клиническое применение способа.

Определение концентрации имипенема в крови и трахеобронхиальных аспиратах (ТБА) проводили у 26 недоношенных детей, находившихся на искусственной вентиляции легких. Масса тела при рождении составляла от 910 до 2700 г, гестационный возраст – 25-37 недель. У всех детей развилась «вентилятор-ассоциированная» пневмония. Исследование фармакокинетики имипенема проводили после разового внутривенного введения имипенема/циластатина в дозе 20 мг/кг (доза имипенема 10 мг/кг) через 30 мин, 1, 2, 4, 6 и 8 часов после окончания инфузии. У детей материал на исследование брали от 1 до 3 раз.

Результаты фармакокинетического исследования показали, что через 30 мин после введения антибиотика концентрация имипенема в крови была очень высокая, составляя в среднем 90 мкг/мл (от 20 до 320 мкг/мл). Уже через 1 час она колебалась от 16 до 40 мкг/мл. Период полувыведения имипенема составил около 50 мин. Спустя 6 часов концентрация антибиотика была в пределах от 0,1 до 4 мкг/мл, а через 8 часов – от 0,08 до 0,25 мкг/мл. Превышение МПК возбудителей в крови наблюдалось у всех детей в течение 4 часов и у большинства из них (у 20 из 26) в течение 6 часов после инфузии. Это свидетельствует о том, что выбранный режим дозирования тиенама (имипенема/циластатина) обеспечивает его высокое бактерицидное действие.

В ТБА уже через 30 мин после введения концентрация имипенема достигала высоких цифр и находилась в широких пределах от 1 до 32 мкг/мл. На таком высоком уровне концентрация имипенема держалась в течение 2 часов, а затем постепенно снижалась вдвое к 4 часам и составила в среднем 2±0,22 мкг/мл через 6 часов. Через 8 часов имипенем обнаруживался только у 1/3 обследованных детей в следовых количествах, не превышающих 0,25 мкг/мл. Следует отметить, что концентрация антибиотика в крови и ТБА была примерно одинаковой в интервале от 1 до 6 часов и в несколько раз (от 2 до 64 раз) превышала МПК возбудителя.

Клинические примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1. Ребенок Котлов. История болезни №787

Диагноз: двусторонняя пневмония, тяжелая форма; гипоксически-ишемическое поражение центральной нервной системы (внутрижелудочковое кровоизлияние 2-й степени справа и слева, паренхиматозное кровоизлияние, постгеморрагическая гидроцефалия). Конъюгационная желтуха. Общий отечный синдром. Недоношенность 12 недель.

Ребенок родился 27.02.2002 г. с массой тела 1220 г, длиной тела 35 см, окружностью головы 26 см и окружностью груди 21 см на 28 неделе гестации в очень тяжелом состоянии. С рождения находился на ИВЛ по поводу синдрома дыхательных расстройств. Первые 5 суток жизни ребенок получал эмпирическую антибактериальную терапию цефамезином и амикацином.

Пневмония развилась на 6 сутки жизни и была обусловлена ассоциацией возбудителей, чувствительных к тиенаму (Streptococcus haemolyticus, МПК=0,08 мкг/мл; Providencia shigelloides, МПК=2 мкг/мл; E.coli, МПК=0,5 мкг/мл) и устойчивых к применяемым раннее антибиотикам. Ребенку был назначен тиенам в/в капельно в дозе 20 мг/кг. Фармакокинетические показатели имипенема у этого ребенка были следующие: концентрация имипенема в плазме крови через 4 и 8 часов была равна 1,0 и 0,08 мкг/мл, соответственно, а в ТБА – 0,125 и 0 мкг/мл, соответственно. Была рекомендована индивидуальная схема введения тиенама в разовой 20 мг/кг 4 раза в сутки (имипенем 10 мг/кг).

Пример 2. Ребенок Мухарин. История болезни №752.

Диагноз: Синдром дыхательных расстройств. Двусторонняя пневмония. Гипоксически-ишемическое поражение центральной нервной системы (отек мозга). Конъюгационная желтуха. Недоношенность 11 недель.

Ребенок родился 04.06.2002 г. с массой тела 1450 г, длиной тела 39 см, окружностью головы 27 см и окружностью груди 25 см на 29 неделе гестации. С рождения находился на ИВЛ по поводу тяжелого синдрома дыхательных расстройств. К 7 суткам жизни наросли явления бактериальной пневмонии, этиология которой была представлена Enterococcus,чувствительным к имипенему (МПК=2 мкг/мл). Отмечался значительный лейкоцитоз (31,0×10⁹ /л). Предшествующая терапия антибиотиками (цефазолин, клафоран, нетромицин) не дала положительного результата ввиду устойчивости к ним возбудителя и ребенку был назначен тиенам внутривенно по 20 мг/кг (имипенем 10 мг/кг). При обследовании у ребенка отмечалась почечная недостаточность 2 степени: имел место декомпенсированный метаболический ацидоз. Уровень креатинина в плазме крови составил 110 ммоль/л и мочевины 20 мМоль/л, что обусловило наблюдавшиеся у него фармакокинетические параметры, представленные в таблице.

Как видно из таблицы, через 6 часов у ребенка отмечалась умеренная концентрация имипенема в ТБА, превышающая МПК возбудителя в 2 раза. При этом концентрация в крови была уже низкой. Поэтому был рекомендован 6-часовой интервал между введениями препарата, с увеличением дозы (то есть, тиенам по 25 мг/кг 4 раза в сутки). Курс лечения составил 10 дней, по окончании которого отмечалась существенная положительная динамика в клиническом состоянии ребенка и санация дыхательных путей.

Клинический пример 3. Ребенок Щедко. История болезни №1629.

Клинический диагноз: асфиксия в родах. Двусторонняя пневмония, трахеобронхит. Гипоксически-ишемическое поражение центральной нервной системы (внутрижелудочковое кровоизлияние справа 2-й степени и слева 3-й степени). Двусторонняя пахово-мошоночная грыжа. Конъюгационная желтуха 2-й степени. Общий отечный синдром. Недоношенность 14 недель.

Недоношенный мальчик родился 16.05.2002 г. с массой тела 980 г, длиной тела 33 см, окружностью головы 24 см и окружностью груди 23 см на 27-й неделе гестации. С рождения находился на искусственной вентиляции легких по поводу синдрома дыхательных расстройств. Пневмония развилась на 5 сутки жизни и была обусловлена ассоциацией Staphylococcus aureus и Enterococcus (МПК имипненма = 0,5 и 2 мкг/мл, соответственно). Отмечалось повышение температуры тела до 39°С, лейкоцитоз (20,1×10⁹/л), выраженный метаболический ацидоз. Ребенок периодически давал приступы апноэ. Эмпирическую антибактериальную терапию проводили антибиотиками медоцеф + амикацин 5 дней, затем фортум + амикацин 3 дня, которые были отменены ввиду их клинической неэффективности. На основании полученного результата микробиологического исследования ТБА ребенку был назначен тиенам в разовой дозе 20 мг/кг внутривенно капельно. Фармакокинетические параметры имипенема: концентрация через 30 мин в плазме крови 310 мкг/мл, в ТБА – 20 мкг/мл, через 6 часов – в ТБА – 8 мкг/мл. Учитывая медленное выведение антибиотика из организма глубоконедоношенного ребенка (27 недель) вследствие нарушения функции почек, был рекомендован 8-часовой интервал между введениями препарата (то есть трехкратное его введение, суточная доза тиенама 60 мг/кг). Курс лечения составил 12 дней с положительным результатом.

Таким образом, предлагаемый способ определения концентрации имипенема в биологических жидкостях у новорожденных детей с тяжелой пневмонией позволяет применять индивидуальные схемы антибактериального лечения с учетом фармакокинетики этого препарата и чувствительности возбудителей, а также разработать стандартные схемы его применения у новорожденных детей с различной степенью зрелости организма и тяжестью инфекционного процесса с ненарушенной и нарушенной функцией почек.

ЛИТЕРАТУРА

3. Формуляр антибиотиков для детских отделений реанимации и интенсивной терапии. – Москва, 2002. – 16 с.

Формула изобретения

Способ определения концентрации имипенема в биологических жидкостях у новорожденных детей, характеризующийся тем, что используют микробиологический метод диффузии в агаре, включающий использование тест-системы Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893), который культивируют в питательной среде следующего состава: панкреатический гидролизат кильки -18 г, агар микробиологический -18 г, хлорид натрия 7,5 г и вода дистиллированная – 1000 мл.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 25.10.2006

Извещение опубликовано: 20.02.2008 БИ: 05/2008