Патент на изобретение №2257415

(54) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ АТОКСИГЕННЫХ ШТАММОВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ ОТ ТОКСИГЕННЫХ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и может быть использовано в микробиологических исследованиях для оценки эпидемической значимости. Для реализации способа используют плотную питательную среду – агар Мартена с рН 9,0, с индикатором – Нильским голубым сульфатом и субстратом – эмульгированным куриным жиром – в концентрации 1,0-1,2 мг и 1,0-1,5 мл соответственно на 100 мл среды. Посевы инкубируют на указанной среде в течение 48 часов при температуре 37°С. Токсигенные холерные вибрионы, не обладающие липазной активностью, образуют микрогазон, окрашенный, как и среда, в голубой цвет. В то же время при проявлении липазной активности, характерной для атоксигенных (гемолитичных) штаммов холерных вибрионов, микрогазон окрашивается в желтый или бутылочно-зеленый цвет на голубом фоне питательной среды. Способ обеспечивает стандартизацию при одновременном упрощении его реализации.

Изобретение относится к микробиологии, а именно к дифференциации токсигенных штаммов холерных вибрионов от гемолитичных – атоксигенных.

Тест Грейга заключается в том, что к 1 мл суточной бульонной культуры в пробирке добавляют 1 мл взвеси эритроцитов барана, трижды отмытых физиологическим раствором. После 24-часовой инкубации при 37°С учитывают реакцию. При положительной реакции наступает лизис эритроцитов (лаковая кровь), культуру считают атоксигенной – гемолитичной. В случае отрицательного результата происходит осаждение эритроцитов в виде четкого колечка на дне пробирки – культуру считают токсигенной.

Тест гемолиза по Грейгу не экономичен – для его постановки необходима свежая кровь, наличие животного, удовлетворительные условия его содержания; не отличается стандартностью и воспроизводимостью и сопровождается трудоемкостью взятия крови у животного.

Известно, что ген, кодирующий продукцию липазы (hlyС или lipA), входит в состав области гена hly, отвечающего за продукцию гемолизина (Fiore F., 1992). Авторами изобретения установлено, что очищенные препараты гемолизинов проявляют липазную активность до гемолитического титра. Исследованные атоксигенные (гемолитичные) штаммы холерных вибрионов в 90% случаев обладают липазной активностью, в то время как токсигенные штаммы (hly^–) не способны осуществлять гидролиз жиров.

Целью предложенного изобретения является способ дифференциации атоксигенных -гемолитичных штаммов холерного вибриона от токсигенных по ферментативному маркеру – липазной активности; поиск альтернативы, упрощение и стандартизация способа в сравнении с известным тестом Грейга.

Поставленная цель достигается тем, что на чашку Петри с агаром Мартена рН 9,0, содержащим индикатор – Нильский голубой сульфат в концентрации 1,0-1,2 мг/100 мл среды и субстрат – куриный жир в концентрации 1,0-1,5 мл/100 мл (среды), эмульгированный с помощью 0,1 мл “Прогресса”, наносят 1 петлю (d – 2 мм) исследуемой культуры и инкубируют посевы 48 часов при 37°С. При проявлении липазной активности, характерной для атоксигенных – гемолитичных штаммов, после инкубации непрозрачный, плотный микрогазон приобретает желтое или бутылочно-зеленое окрашивание на питательной среде голубого цвета.

У токсигенных холерных вибрионов в отсутствие липазной активности наблюдается рост прозрачного нежного микрогазона голубого, одинакового с питательной средой цвета. Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. На чашку Петри с агаром Мартена рН 9,0, содержащим 1 мг индикатора Нильского голубого сульфата на 100 мл среды, 0,1 мл/100 мл “Прогресса”, 1,0 мл/100 мл растопленного эмульгированного куриного жира, наносят 1 петлю (d – 2 мм) культуры Vibrio cholerae eltor 14156 (ctx^–, hly⁺). Через 48 часов инкубации при 137°С наблюдается рост непрозрачного, плотного микрогазона желтого цвета.

Пример 2. Выполняют подобно примеру 1, но используют агар Мартена, содержащий 1,2 мг индикатора Нильского голубого сульфата на 100 мл среды, 1 мл/100 мл “Прогресса”, 1,5 мл/100 мл растопленного эмульгированного куриного жира. Через 48 часов инкубации культура Vibrio cholerae eltor 14156 (ctx^–, hly⁺) окрашивается в бутылочно-зеленый с желтым оттенком цвет.

Пример 3. Выполняют подобно примеру 1, но используют токсигенный штамм V.cholerae cholerae 569 В (ctx⁺). После 48 часов инкубации наблюдается рост в виде микрогазона светло-голубого цвета.

Пример 4. Выполняют подобно примеру 2, но используют токсигенный штамм V.cholerae eltor 5879 (ctx⁺). После 48 часов инкубации культура окрашивается в голубой одинаковый со средой цвет.

Эффективность способа изучена на 60 штаммах V.cholerae 4-x групп: 1 – штаммы, выделенные от людей hly⁺, ctx^–; 2 – штаммы из внешней среды hly⁺, ctx^–; 3 – штаммы из внешней среды ctx⁺ hly^–; 4 – штаммы, выделенные от людей ctx⁺ hly^–.

Предлагаемый способ позволяет легко, с высокой демонстративностью дифференцировать токсигенные штаммы холерного вибриона от атоксигенных (гемолитичных), является альтернативой тесту Грейга. Способ прост в постановке, легко учитываем, не требует наличия свежей крови и содержания барана, как в прототипе. Куриный жир одной серии (100 мл), достаточный для приготовления 10000 мл среды – 2000 исследований, можно хранить в условиях морозильной камеры (-20°С) в течение 2-х лет и более.

Предлагаемый способ может быть использован при работе с большим количеством штаммов возбудителя (деление 1 чашки со средой на 6 секторов), с целью дифференциации hly⁺, ctx^– и hly^– ctx⁺ штаммов.

Возможно приготовление питательной среды (агара Мартена с соответствующими ингредиентами) заранее, готовые чашки с питательной средой могут храниться при t (6±2)°С в течение 10-20 дней (срок наблюдения).

Формула изобретения

Способ дифференциации атоксигенных штаммов холерных вибрионов от токсигенных, включающий нанесение исследуемых культур на питательную среду с индикатором и субстратом и учет результатов по изменению окраски индикатора, отличающийся тем, что в качестве питательной среды используют агар Мартена с рН 9,0 с индикатором – Нильским голубым сульфатом в концентрации 1,0-1,2 мг/100 мл среды и субстратом – эмульгированным куриным жиром в концентрации 1,0-1,5 мл/100 мл, затем проводят инкубацию в течение 48 ч при температуре 37°С, после этого по окрашиванию микрогазона в желтый или бутылочно-зеленый цвет с желтым оттенком дифференцируют атоксигенные штаммы холерных вибрионов, обладающие липазной активностью, от токсигенных, не имеющих окраску микрогазона.