Патент на изобретение №2257414

(54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК С3/S-3E5 ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS L., ПРОДУЦИРУЮЩИХ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К КОКСИЕЛЛАМ БЕРНЕТА

(57) Реферат:

Изобретение относится к гибридомной технологии и представляет собой новый штамм гибридных клеток C3/S-3E5 животных Mus musculus L., продуцирующих в клеточных культурах и брюшной полости сингенных животных моноклональные антитела (далее МКАт) к коксиеллам Бернета (штамм “Грита”). В результате слияния миеломы мыши линии Sp-2/0 и спленоцитов мышей BALB/c, иммунизированных инактивированным формалином концентрированным очищенным препаратом коксиелл Бернета (штамм “Грита”), при использовании в качестве сливающего агента полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1000 и последующего клонирования методом предельных разведений получена гибридома C3/S-3E5, продуцирующая МКАт к данному возбудителю. Специфичность полученных МКАт: отсутствие перекрестных реакций в ИФА с антигеном риккетсий Провачека, а также с неинфицированным субстратом накопления. С помощью полученных МКАт можно проводить специфическое выявление коксиелл Бернета методом ИФА (прямой и непрямой варианты). Чувствительность ИФА на основе данных МКАт составляет 2,0· 10³ ИД₅₀· см^-3 для белых крыс. Использование изобретения позволяет выявить и идентифицировать возбудителей риккетсиозной этиологии. 1 ил., 3 табл.

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, а именно к гибридомной технологии, и представляет собой новый штамм гибридных клеток C3/S-3E5 животных Mus musculus L., продуцирующих в клеточных культурах и брюшной полости сингенных животных моноклональные антитела (далее МКАт) к коксиеллам Бернета (штамм “Грита”), который может быть использован в научных исследованиях и при изготовлении медицинских иммунобиологических препаратов.

Изобретение может быть использовано в микробиологических и иммунологических исследованиях при создании диагностикумов для выявления в пробах от людей и переносчиков коксиелл Бернета – возбудителей лихорадки Ку.

Лихорадка Ку относится к зооантропонозам с природной очаговостью и распространена во многих странах мира [1-7]. Особенности патогенеза инфекции у человека и своеобразие клинических проявлений коксиеллеза создает большие трудности в распознавании заболевания [1,8-10].

Для обнаружения специфических антигенов возбудителей различных инфекционных заболеваний вирусной и риккетсиозной этиологии в последнее время широкое применение получили иммунохимические методы, в частности иммуноферментный анализ (далее ИФА). Одним из наиболее перспективных направлений повышения эффективности ИФА является использование МКАт как антителсодержащего субстрата, применяемого в качестве диагностикума. Однако вопрос о возможности использования МКАт для выявления и идентификации возбудителей риккетсиозной этиологии остается до настоящего времени нерешенным.

Применение МКАт к коксиеллам Бернета для диагностики лихорадки Ку на ранней стадии заболевания может исключить ложноположительные реакции, нередко возникающие при использовании тест-систем на основе поликлональных иммунных сывороток. Необходимо также отметить, что использование МКАт позволит создавать стандартизованные тест-системы за счет возможности применения антител постоянной авидности и специфичности.

При разработке на основе МКАт диагностикумов, предназначенных для выявления возбудителей опасных и особо опасных инфекционных заболеваний вирусной и риккетсиозной этиологии, актуальным является вопрос получения достаточной биомассы последних. С этой целью проводят культивирование клеток гибридом различными методами in vitro или in vivo.

Перспективным направлением исследований является выбор и обоснование условий метода культивирования гибридом in vitro, позволяющих получать биомассу МКАт, количественно сопоставимую с таковой при выращивании клеток гибридом in vivo.

Целью настоящего изобретения является получение гибридомы, продуцирующей МКАт к коксиеллам Бернета, которые используют в качестве антителсодержащего субстрата в серологических тестах при выявлении и идентификации данного возбудителя.

Сущность изобретения состоит в том, что в результате слияния миеломы мыши линии Sp-2/О и спленоцитов мышей BALB/c, иммунизированных инактивированным очищенным концентрированным антигеном коксиелл Бернета, при использовании в качестве сливающего агента полиэтиленгликоля (далее ПЭГ) с молекулярной массой 1000 и последующего клонирования методом предельных разведений получена гибридома C3/S-3E5, продуцирующая МКАт к коксиеллам Бернета. Данные МКАт позволяют проводить специфическое выявление коксиелл Бернета методом ИФА (прямой и непрямой варианты). Чувствительность ИФА на основе МКАт составляет 2,0· 10³ ИД₅₀· cм^-3.

Пример выполнения

Полученный штамм гибридных клеток C3/S-3E5 животных Mus musculus L., продуцирующих моноклональные антитела к коксиеллам Бернета, обладает следующими характеристиками:

1. Родословная гибридомы представлена на чертеже.

2. Число пассажей к моменту паспортизации составляет 14 раз.

3. Стандартные условия выращивания in vitro:

– посевная концентрация при выращивании in vitro 2,0· 10⁵ кл· см^-3;

– среда культивирования – среда Игла в модификации Дюльбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (далее ФТС);

– температура культивирования (37±0,5)° С;

– содержание СО₂ в атмосфере культивирования 5%.

4. Культуральные свойства штамма

Штамм является монослойно-суспензионным: около 30% клеток находятся в суспензии, не прикрепляясь к поверхности культурального сосуда. Частота пассирования при посевной дозе 2,0· 10⁵ кл· см^-3 составляет от 3 до 4 суток. Индекс пролиферации при выращивании in vitro равен 7,2.

5. Ростовые (кинетические) характеристики гибридомы представлены таблице 1.

6. Характеристика культивирования в организме животного

При внутрибрюшинном введении мышам BALB/c от 2,0· 10⁶ до 5,0· 10⁶ клеток гибридомы на 9-21 сутки формируются серозные опухоли. От одной мыши получают от 2,0 до 3,0 см³ иммунной асцитической жидкости (далее ИАЖ). Концентрация клеток гибридомы в ИАЖ составляет от 30· 10⁶ до 50· 10⁶ кл· см^-3.

7. Цитогенетическая (кариологическая) характеристика:

– модальный класс от 88 до 96 хромосом;

– доля клеток в модальном классе – 54%;

– модальный класс для родительской миеломной линии Sp-2/O – от 57 до 59 хромосом.

8. Цитоморфологическая характеристика

Клон гибридомы представлен крупными округлыми клетками с размерами от 20 до 25 мкм, близкими по морфологии клеткам исходной миеломы линии Sp-2/O.

9. Видовая принадлежность Mus musculus.

10. Онкогенность

Гибридома при внутрибрюшинном введении вызывает серозные (в 70% случаев) и солидные опухоли.

11. Маркерные характеристики

Клон продуцирует МКАт к коксиеллам Бернета.

12. Контроль контаминации

Грибковая и бактериальная микрофлора в культуре штамма гибридомы отсутствует.

13. Биотехнологическая характеристика

Штамм продуцирует МКАт к коксиеллам Бернета:

– титр МКАт при выращивании in vitro – 1:2560 (в ИФА);

– титр МКАт при выращивании in vivo – 1:163840 (в ИФА).

Характеристика продуцируемых МКАт к коксиеллам Бернета:

– белок-мишень – антиген I фазы коксиелл Бернета, структурный белок с молекулярной массой (ММ) 62 кДа;

– изотип продуцируемых иммуноглобулинов – IgG;

– количество изученных пассажей: in vitro – 14; in vivo – 5.

Секреторные характеристики гибридомы C3/S-3E5 представлены в таблице 2.

14. Способ криоконсервации

Осадок клеток, полученный после низкоскоростного центрифугирования, ресуспендируют в среде, содержащей 90% ФТС и 10% диметилсульфоксида (DMSO), доводят до конечной концентрации 3,0· 10⁶ кл· см^-3 и разливают в пластиковые ампулы по 0,5 см³. Ампулы охлаждают до температуры минус 70° С в установке для программного замораживания при скорости замораживания от 1 до 2° С в минуту и затем помещают в сосуд Дьюара с жидким азотом.

Клетки гибридомы C3/S-3E5, выращенные in vitro в 24-луночных планшетах до конечной концентрации от 1,0· 10⁶ до 1,5· 10⁶ кл· см^-3, осаждают с помощью низкоскоростного центрифугирования и вводят внутрибрюшинно мышам линии BALB/c, предварительно (за 7 суток) обработанным адъювантом Пристана, в количестве от 2,0· 10⁶ до 5,0· 10 клеток в объеме 0,5 см³. На 9-21 сутки после введения гибридомы примерно у 70% животных формируются асцитные опухоли. Клетки гибридомы осаждают из ИАЖ с помощью низкоскоростного центрифугирования (1500 об· мин ^-1 в течение 10 минут) и используют для последующего пассажа in vivo. Супернатант, содержащий МКАт в высоких титрах, используют в качестве полуфабриката для выделения иммуноглобулина, который используют для получения диагностикума. Данные по чувствительности и специфичности ИФА на основе МКАт C3/S-3E5 представлены в таблице 3.

Как показывает анализ данных, представленных в таблице 3, чувствительность непрямого варианта ИФА на основе МКАт при определении коксиелл Бернета (С. Bumetii) в составе нативного препарата составляет 1,2· 10³ ИД₅₀· г^-1. Специфичность непрямого варианта ИФА на основе МКАт подтверждена отсутствием положительной реакции с антигеном риккетсий Провачека (R. Prowazekii) [12].

Источники информации

11. Васильев Н.Н., Амбросов В.А., Складнев А.А. Моделирование процессов микробиологического синтеза. – М.: Лесная промышленность, 1975.

Формула изобретения

Штамм гибридных клеток C3/S-3E5 животных Mus musculus L., продуцирующих в течение 14 изученных пассажей in vitro моноклональные антитела к коксиеллам Бернета (штамм “Грита”), относящиеся к изотипу IgG, пригодные для приготовления на их основе диагностикумов для специфического выявления коксиелл Бернета (1-й фазы) с помощью иммуноферментного анализа.

РИСУНКИ