Патент на изобретение №2257412

(54) ШТАММ HAEMOPHILUS INFLUENZAE B MECH №1 – ПРОДУЦЕНТ КАПСУЛЬНОГО ПОЛИСАХАРИДА – ПОЛИРИБОЗИЛРИБИТОЛФОСФАТА

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Штамм выделен от больного менингитом ребенка и депонирован в коллекции ГИСК им. Л.А.Тарасевича под №267. Штамм продуцирует капсульный полисахарид – полирибозилрибитолфосфат на синтетической и полусинтетической питательных средах.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине.

Задачей предлагаемого изобретения является получение капсульного полисахарида полирибозилрибитолфосфат на синтетической и полусинтетической питательных средах.

Для решения указанной задачи предлагается штамм Haemophilus influenzae b Mech №1, депонированный Коллекцией Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича под номером 267. Штамм Haemophilus influenzae b Mech №1 является клиническим изолятом, полученным от больного менингитом ребенка.

Культурально-морфологические и другие свойства штамма. Штамм Haemophilus influenzae b Mech №1 растет на полноценных питательных средах с добавлением факторов роста – сыворотки крови или НАД и гемина; по Грамму окрашивается отрицательно. В мазках проявляется типичный для данного вида плеоморфизм.

Рост на твердых питательных средах. Штамм Haemophilus influenzae b Mech №1 растет на шоколадном агаре (среде Левинталя), сердечно-мозговом агаре с добавлением НАД и гемина; образует мелкие, прозрачные как капли росы колонии с голубой опалесценцией в косопроходящем свете. Оптимальная температура роста 37°С.

Рост на жидких питательных средах. Штамм Haemophilus influenzae b Mech №1 при росте на сердечно-мозговом бульоне с добавлением НАД и гемина вызывает равномерное помутнение среды.

Биохимическая активность штамма. Штамм Haemophilus influenzae b Mech №1 дает положительную реакцию на каталазу, оксидазу, фосфатазу, не образует сероводорода, сбраживает глюкозу, галактозу, мальтозу, рибозу и ксилозу с образованием кислоты, восстанавливает нитраты до нитритов. Нуждается в факторах роста – НАД и гемине.

Отношение штамма к видовым диагностическим сывороткам. Штамм Haemophilus influenzae b Mech №1 вызывает агглютинацию серотиповой сыворотки.

Антигенные свойства штамма. Штамм Haemophilus influenzae b Mech №1 продуцирует специфический для данного серотипа капсульный полисахарид – полирибозилрибитолфосфат.

Активность (продуктивность) штамма, а также другие производственные показатели штамма. Штамм Haemophilus influenzae b Mech №1 способен продуцировать капсульный полисахарид при росте на полусинтетической (на основе аминопептида) и синтетической питательных средах. Количество капсульного полисахарида в среде культивирования спустя 6-8 часов после достижения культурой стационарной фазы роста по результатам ракетного иммуноэлектрофореза (РИЭФ) составляет 100 мкг/мл. Для определения активнеости капсульного полисахарида, выделенного в среду культивирования, оценивают по результатам РИЭФ культурального супернатанта и очищенного полисахарида в качестве референс-препарата с использованием гиперимунных кроличьих сывороток против Haemophilus influenzae тип b.

Условия и состав сред для хранения. Штамм Haemophilus influenzae b Mech №1 хранят в высушенном состоянии, высушивают в сахарозо-желатиновом стабилизаторе. Хранят в ампулах под вакуумом при температуре 4-6°С.

Условия и состав сред для размножения штамма. Для культивирования штамма используют шоколадный агар или сердечно-мозговой агар (Difco) с добавлением 4 мг/л НАД и 10 мг/л гемина. Культивируют при 37°С в течение 18-22 ч.

Условия и состав сред для получения капсульного полисахарида. Для получения капсульного полисахарида штамм Haemophilus influenzae b Mech №1 культивируют на полусинтетической питательной среде на основе аминопептида или на синтетической питательной среде. Выращивание осуществляют при 37°С в условиях принудительной аэрации. После достижения культурой стационарной фазы роста инкубацию продолжают 6-8 часов.

Пример. Культуру инкубировали в течение 18 ч. На сердечно-мозговом бульоне (Difco) с добавлением 4 мг/л НАД и 10 мг/л среды гемина (ICN). Затем инокулировали в жидкую синтетическую питательную среду и жидкую полусинтетическую питательную среду на основе аминопептида, а также высеяли на сердечно-мозговой агар (Difco) с добавлением НАД и гемина. Начальная концентрация клеток в жидких средах составляла 10⁸ клеток.

На сердечно-мозговом агаре культуру выращивали в термостате при 37°С в течение 18 ч. На твердой питательной среде культура образует мелкие слизистые, блестящие колонии с голубой опалесценцией в косопроходящем свете. Культура окрашивалась по Грамму отрицательно и имела типичную для данного микроорганизма морфологию. В реакцию агглютинации с серотиповой сывороткой против Haemophilus influenzae тип b культура давала положительную реакцию

Культивирование на жидких питательных средах проводили при 37°С на шуттеле при 200 об/мин. После достижения культурой стационарной фазы роста инкубацию продолжали в течение 6 часов. Затем в культуру добавили 0,1% формалина. Клетки отделили центрифугированием при 5000 об/мин в течение 15 мин. В супернатанте определили количество капсульного полисахарида методом ракетного иммуноэлектрофореза с очищенным капсульным полисахаридом в качестве референс-препарата и гипериммунной кроличьей сывороткой против Haemophilus influenzae тип b. Количество капсульного полисахарида составляло 100 мкг/мл и 50 мкг/мл культурального супернатанта при культивировании на синтетической и полусинтетической питательных средах соответственно.

Формула изобретения

Штамм Haemophilus influenzae b Mech №1 (коллекция ГИСК им. Л.А.Тарасевича №267), используемый в качестве продуцента капсульного полисахарида – полирибозилрибитолфосфата.