Патент на изобретение №2256921
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ЛИМФОЛЕЙКОЗА
(57) Реферат:
Изобретение относится к области медицины, в частности к гематологии. Способ позволяет повысить точность прогнозирования течения хронического лимфолейкоза. Проводят определение в крови количества CD20 позитивных В-лимфоцитов человека методом иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител и при уровне CD20+ клеток от 0,4 до 7,0×109/л. прогнозируют не прогрессирующее течение хронического лимфолейкоза, а при уровне CD20+ клеток выше 7,0×109/л – прогрессирующее течение. 1 табл., 1 ил.
Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, может быть использовано для прогнозирования развития и течения хронического лимфолейкоза (ХЛЛ). Согласно современным представлениям, нашедшим отражение в последних классификациях (Real, ВОЗ), ХЛЛ относится к заболеваниям периферических органов иммунной системы. Морфологическим субстратом ХЛЛ является клон CD5+ В-лимфоцитов (с имунофенотипом CD5+, CD19+, CD20+, CD23+, слабой экспрессией CD22 и поверхностных иммуноглобулинов, FMC7-), аналогичный нормальным CD5+ В-лимфоцитам мантийной зоны вторичного фолликула лимфоузла, участвующим в независимом от Т-лимфоцитов иммунном ответе [F.Caligaris-Cappio et al. Sixth Meeting of the European Hematology Association, Frankfurt, Germany, 21-24 June 2001, Educational book, pp.102-106, P.Youinou et al. Immunol Today. 1999, 20, 312-316]. В последние годы подходы к лечению ХЛЛ радикально изменились. Эти изменения вызваны не только появлением новых, более эффективных, чем прежние, средств терапии, но и значительными успехами в понимании биологии заболевания, что реализовывалось в выделении новых прогностических критериев, учитываемых в настоящее время при определении необходимости в интенсивной терапии. Все формы с прогрессирующим течением требуют назначения полихимиотерапии, при данном течении прогноз неблагоприятный, наблюдается лекарственная резистентность. Таким образом, раннее определение прогноза позволило бы: – оптимизировать терапию данного заболевания; – повлиять на качество жизни этих пациентов; – снизить количество затрачиваемых средств государством на лечение данных больных. Аналогом изобретения является способ прогнозирования течения ХЛЛ путем определения хромосомных нарушений. По мнению большинства исследователей, наличие дополнительной хромосомы 12 прогностически неблагоприятно [Juliusson G., Merup M. Sem. Oncol. – 1998. – Vol.25. – P.19-26]. Существует точка зрения, что дополнительная хромосома не влияет на прогноз [Geisler С., Philip P., Christensen В. et al Leuk. Res. – 1997. – Vol.2 1.P.1011-1023]. Также есть мнение, что хронический лимфолейкоз с трисомией 12 представляет собой отдельный вариант болезни с атипичной морфологией лимфоцитов и относительно неблагоприятным течением [Oscier D.G. In: VIII intemat Worksh. On CLL. Darwin medical Communication Ltd. – Oxford Chise, U.K.,1999 – P.17]. Крайне неблагоприятны в прогностическом отношении и делеции хромосомы 11 [Neilson J., Auer R., White D. et al. Leukemia. – 1997. -Vol.11. – P.1929-1932]. Медиана выживаемости у данных больных 64 мес. Недостатками данных способов является следующее. 1. Дороговизна и значительная трудоемкость выполнения данной методики как в амбулаторных, так и в условиях стационарна. 2. Достаточно разнообразный выбор неблагоприятных в прогностическом отношении хромосомных нарушений. 3. Большое количество противоречивых литературных данных относительно возможного прогностического значения того или иного хромосомного нарушения. Известен способ прогнозирования развития ХЛЛ путем определения сывороточного уровня интерлейкина-6 (ИЛ-6), который является индикатором активности течения ХЛЛ [Robak Т., Wierzbowska A., Blasinska-Morawiec M., et al: Mediators inflamm. – 1999. – Vol. 8(6). – P.277-86]. Так в работе [Fayad L., Keating M.J., Reuben J.M., at al: Blood. – 2001. – Vol. 97(1). – P.256-63] показано, что уровень ИЛ-6 и ИЛ-10 был выше у пациентов с ХЛЛ по сравнению с контролем. Пациенты с повышенным уровнем ИЛ-6 и/или ИЛ-10 имели худшую медиану или 3-хлетнюю выживаемость и неблагоприятные характеристики (предшествующая температура, увеличение уровня бета-2 микроглобулина или лактат-дегидрогеназы или стадию заболевания по Раи III или IV. Результаты [Hulkkonen J., Vilpo J., Vilpo L., et al: Br J Haematol. – 1998. – Vol. 100 (3). – P.478-83], свидетельствуют, что различная способность продуцировать ИЛ-6 и фактора некроза опухоли-альфа (TNF- Однако этот способ имеет: 1) относительно высокую вариабельность сывороточного уровня (СУ) ИЛ-6 даже в течение суток у одного и того же пациента (например, утреннее или послеобеденное время); 2) наличие сопутствующих заболеваний у пациентов может существенно влиять на регистрируемый СУ ИЛ-6. Главным недостатком способа является невозможность выделить группы благоприятного (неблагоприятного) течения заболевания на начальной стадии и тем самым осуществить своевременные профилактические мероприятия (адекватная химиотерапия). Прототипом данного изобретения является способ диагностики ХЛЛ описанный В.Desablens [В.Desablens et al. Prognostic factors among 477 patients with stage A B-CLL. Leukemia 2000 towards the cure. Program and abstract book, p.62, abstr. P068], информирующий о неблагоприятной роли воздействия высокого уровня лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и b2-микроглобуллина. Показано, что при уровне ЛДГ, превышающем нормальный в 1,25 раза, медиана продолжительности жизни составляет 4,4 года, в то время как при нормальном уровне – 12,6 лет; при концентрации b2-микроглобуллина более 3 мг/л – 4,6 лет, менее 3 мг/л – 12,6 лет. Однако недостатками данного метода является следующее. 1. Отсутствие данных об изменении уровней ЛДГ и Ь2-микроглобуллина при ХЛЛ в зависимости от вариантов течения заболевания. 2. Наличие сопутствующих заболеваний у пациентов может существенно влиять на уровень ЛДГ. Технический результат – повышение точности прогнозирования течения хронического лимфолейкоза. Технический результат достигается тем, что на ранней стадии развития заболевания определяют в крови больного количество CD20 позитивных В-лимфоцитов методом иммунофлюоресценции и при уровне CD20+ от 0,45 до 7,0×109/л прогнозируют не прогрессирующее течение хронического лимфолейкоза, а при CD20+ выше 7,0×109/л – прогрессирующее течение. На чертеже показано соотношение количества CD20+(×109/л) у больных ХЛЛ с прогрессирующим и не прогрессирующим течением заболевания и в контрольной группе. Способ осуществляется следующим образом: в крови больного определяют количество CD20 позитивных В-лимфоцитов иммунофлюоресцентным методом с использованием моноклональных антител. Материалом для иммунофлуоресцентного метода служат образцы крови пациентов с ХЛЛ. Кровь набирают в пробирки объемом 5 мл с 2 каплями консерванта (Sol. NaCl 0,9%: Sol Heparini в соотношении 1:1). Лимфоциты выделяют из крови центрифугированием на градиенте Фиколл-Верографина (плотность 1,077 г/мл). 1-0,1 млн лимфоцитов в объеме 50 мкл вносят в центрифужные пробирки или лунки 96-луночного круглодонного планшета. К клеткам добавляют 5 мкл тестируемого моноклонального антитела и инкубируют 30-45 мин при +4°С. Добавляют 150 мкл раствора Хенкса и центрифугируют 5 мин при 200 г (1200 об/мин на центрифуге с радиусом 15 см). Удаляют супернантант. Затем вносят 50 мкл раствора Хенкса, клетки суспендируют, добавляют 150 мкл раствора Хенкса и центрифугируют 5 мин при 200 г. К осадку отмытых клеток добавляют 50 мкл F(ab Окрашенные клетки анализируются на проточном цитометре или просматриваются с помощью флуоресцентного микроскопа. В последнем случае клетки суспендируют, суспензия переносится на предметное стекло, накрывается покровным стеклом и препарат просматривается под иммерсией на флуоресцентном микроскопе (объектив ×90). Наилучшее качество изображения достигается при использовании окуляров с небольшим увеличением (×3 или даже ×1,7). Рекомендуется использовать нефлуоресцирующее имерсионное масло. Наблюдение следует проводить в затемненном помещении. Количество антиген позитивных клеток определяют как процент флуоресцирующих клеток при просматривании 200 лимфоцитов за вычетом % флуресцирующих клеток, наблюдаемых в препарате отрицательного контроля. В качестве отрицательного контроля используют препараты, подготовленные аналогичным образом, за исключением того, что вместо моноклональных антител клетки обрабатывают раствором Хенкса или нормальными Ig мыши. В качестве контроля обследовали группу здоровых индивидов, проживающих на территории республики Башкортостан (20 человек), у которых отсутствовали какие-либо злокачественные заболевания. В группу с непрогрессирующим течением ХЛЛ вошли больные с медленным нарастанием лейкоцитоза, очаговым типом роста в костном мозге, незначительным увеличением периферических лимфоузлов и селезенки. В начальной стадии заболевания больным данной группы назначается терапия препаратом В группу с прогрессирующим течением ХЛЛ вошли больные с прогрессирующей формой (быстрое увеличение лимфоузлов и селезенки, диффузный или диффузно-интерстициальный рост опухоли в костном мозге), опухолевой формой ХЛЛ (наличие больших плотных конгломератов лимфоузлов, диффузный рост опухоли в костном мозге) и абдоминальной формой (отличающейся наличием конгломератов лимфоузлов в брюшной полости и диффузной пролиферации в трепанате). Данным категориям больных требовалось назначение полихимиотерапии. Суть терапии сводится к ограничению лейкемического процесса постоянными дозами цитостатических препаратов с целью достижения стойкой ремиссии. Группа больных ХЛЛ с непрогрессирующим течением составила 13 человек, группа с прогрессирующим течением заболевания – 11 человек. В качестве контроля обследована группа практически здоровых доноров, подобранных в соответствии с возрастом и полом исследуемых групп больных. В таблице 1 приведены данные проведенного анализа уровня CD20+ у больных ХЛЛ в зависимости от течения заболевания.
Как видно, из полученных данных, уровень CD20+ у больных хроническим лимфолейкозом был достоверно выше по сравнению с контролем (р<0,05). На чертеже видно, что, у больных ХЛЛ в зависимости от течения заболевания сывороточный уровень CD20+ был достоверно выше в группе больных с прогрессирующим течением заболевания (р<0,05). Надо отметить, что наиболее показательными являются цифры уровня CD20+, указанные в абсолютных единицах (×109/л). Для иллюстрации приводим клинические примеры. Пример 1: Больная М-о., 1932 года рождения, город Учалы, Республика Башкортостан. Диагноз ХЛЛ установлен в апреле 1995 года, подтвержден стернальной пункцией, костный мозг богат клеточными элементами, представлен зрелыми лимфоцитами 79%. Регулярно получает полихимиотерапию с включением циклофосфана, преднизолона. В настоящее время диагноз ХЛЛ, стадия по К.Rai III, продолжает принимать лечение, наблюдается прогрессирование течения заболевания, увеличение количества лимфоузлов, увеличение их до 2,5 см в диаметре, группирование их в конгломераты, при пальпации отмечается болезненность. Кровь набирали в пробирки объемом 5 мл с 2 каплями консерванта (Sol. NaCl 0,9%: Sol Heparini в соотношении 1:1). Количество антиген позитивных клеток определяли как процент флуоресцирующих клеток при просматривании 200 лимфоцитов за вычетом % флуресцирующих клеток, наблюдаемых в препарате отрицательного контроля. Количество таких клеток составило-СВ20+ -3,5×109/л, (CD20+-4%) у данного пациента. Полученные данные позволяют прогнозировать не прогрессирующее течение заболевания. Пример 2. Пациентка С-ва, 1950 года рождения, г.Сибай, Республика Башкортостан. Диагноз ХЛЛ установлен в октябре 2000 года, подтвержден стернальной пункцией, 92%-зрелых лимфоцитов. Неоднократно проводилось лечение циклофосфаном и преднизолоном. Кровь набирали в пробирки объемом 5 мл с 2 каплями консерванта (Sol. NaCl 0,9%:Sol Heparini в соотношении 1:1). Количество антиген позитивных клеток определяли как процент флуоресцирующих клеток при просматривании 200 лимфоцитов за вычетом % флуресцирующих клеток, наблюдаемых в препарате отрицательного контроля. Количество таких клеток составило – С020+-21,67×109/л, (CD20+-15%) у данного пациента. Смерть наступила в декабре 2002 г., на фоне прогрессирования лимфоцитоза до 232×109/k, анемии -Нв-39 г/л, Тромбоцитопении-Plt-38×109/л. Гиперсплено-, -гепатомегалия. Полученные данные позволяют прогнозировать прогрессирующее течение болезни. Данным способом проведена диагностика течения ХЛЛ у 24 больных. Определение не прогрессирующего течения заболевания позволило назначать более щадящую терапию и отказаться от той, которая вызывает осложнения и влияет на качество жизни больного.
Формула изобретения
Способ прогнозирования течения хронического лимфолейкоза, включающий определение в крови количества CD20 позитивных В-лимфоцитов человека методом иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител и при уровне CD20+ клеток от 0,4 до 7,0×109/л прогнозируют непрогрессирующее течение хронического лимфолейкоза, а при уровне CD20+ клеток выше 7,0×109/л – прогрессирующее течение.
РИСУНКИ
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||
) может играть роль при В-ХЛЛ прогрессии и клинической манифестации этого заболевания.
)2-фрагментов овечьих антител к Ig мыши, меченных флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) и разведенных 1:100. Для разведения используют физраствор, забуференный фосфатами (PBS), содержащий 0,5% желатины и 0,1% азида натрия (вместо PBS можно использовать раствор Хенкса). Клетки суспендируют и инкубируют 30 мин при +4°С. Клетки 2 раза отмывают как указано в пп.3-4. Клетки готовы для наблюдения иммунофлуоресценции, однако, если результаты теста будут учитываться лишь через несколько часов, то клетки необходимо зафиксировать. Для этого после заключительного центрифугирования и удаления супернантанта к осадку клеток добавляют 50 мкл 1% пароформальдегида на PBS (можно использовать раствор формалина, разведенный 1:40 на PBS). Клетки суспендируют. Фиксированные клетки сохраняют флуоресценцию в течение недели.
Лейкеран