Патент на изобретение №2256916

(54) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА И САРКОИДОЗА ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, в частности к фтизиатрии и пульмонологии, и может быть использовано в противотуберкулезных учреждениях и в учреждениях общей лечебной сети. Способ дифференциальной диагностики туберкулеза и саркоидоза органов дыхания характеризуется тем, что определяют активность миелопероксидазы (МП) и содержание катионных белков (КБ) в фагоцитах крови, и при содержании КБ более 105 усл.ед. и нормальной и повышенной активности МП диагностируют саркоидоз, а при содержании КБ менее 105 усл.ед и пониженной активности МП – туберкулез легких. Способ по изобретению позволяет повысить точность диагностики и упростить ее. 2 табл.

Изобретение относится к медицине, в частности к фтизиатрии и пульмонологии, и может быть использовано в противотуберкулезных учреждениях и в учреждениях общей лечебной сети.

Известен способ диагностики саркоидоза с помощью антигена Квейма. Проба Квейма считается положительной при появлении в месте внутрикожного введения антигена папулы, состоящей из эпителиоидных и лимфоидных клеток. Эффективность данного метода диагностики саркоидоза составляет от 60 до 84% (А.Г.Хоменко и соавт. / Пробл. туберкулеза. – 1991. – №11. – С.33-37).

Недостатком метода является необходимость введения специфического антигена, что может привести к нежелательным последствиям, обусловленным сенсибилизацией организма.

Недостатком данного способа является необходимость получения БАЛЖ у больных и отсутствие четких данных об эффективности метода.

Недостатком данного способа является необходимость подкожного введения туберкулина и фитогемагглютинина, что может привести к известным реакциям (местная, очаговая, общая) и к обострению заболевания.

Недостатком метода является необходимость получения БАЛЖ, а также наличие дорогостоящей аппаратуры для выполнения двухмерной тонкослойной хроматографии с целью получения отдельной фракции дипальмитоилфосфатидилхолина.

Недостатком данного способа является необходимость при каждом исследовании забирать кровь из вены у практически здоровых людей (доноров).

Недостатком способа является отсутствие четких критериев, позволяющих установить диагноз.

Недостатком данного способа является его инвазивность.

Имеется способ дифференциальной диагностики туберкулеза и саркоидоза органов дыхания, заключающийся в определении активных форм кислорода хемилюминисцентным методом в альвеолярных макрофагах и макрофагах из биоптата ткани легкого (Н.Е.Араблинская: Дис…. канд. мед. наук. М. – 2001. – 117 с.). Ведущим критерием для нозологической диагностики этих заболеваний является время возникновения индуцированной хемилюминисценции альвеолярных макрофагов в ответ на стимуляцию микобактериями штамма BCG (4,4±1,1 мин при активном туберкулезе и 18,8±3,3 мин при активном саркоидозе).

Недостатками являются сравнительно невысокая точность и определенные технические сложности (необходимость получения БАЛЖ и альвеолярных макрофагов путем фильтрования лаважной жидкости через капроновый фильтр, дальнейшее центрифугирование, добавление к осадку раствора Хенкса, подсчет в камере Горяева количества выделенных альвеолярных макрофагов) и необходимость наличия дорогостоящей аппаратуры для исследования хемилюминисценции.

Задачей изобретения является повышение точности дифференциальной диагностики туберкулеза и саркоидоза органов дыхания и ее упрощение.

Эта задача решается путем определения в фагоцитах крови уровня неферментных катионных белков (КБ) и активности миелопероксидазы (МП) и при содержании КБ более 105 усл.ед. и нормальной и повышенной активности МП в клетках диагностируют саркоидоз органов дыхания, а при содержании КБ менее 105 усл.ед. и пониженной активности МП диагностируют туберкулез легких.

Практически метод осуществляется следующим способом.

Для определения в фагоцитах крови КБ и МП из локтевой вены в пробирку с 0,1 мл гепарина и 0,9 мл физиологического раствора отбирают 5 мл крови. Затем добавляют 1 мл 10% раствора желатина и помещают в термостат при 37°С на 30-40 минут для оседания эритроцитов. Плазму отбирают и центрифугируют 10 минут при 1000 об/мин, надосадочную жидкость забирают, а к осадку добавляют 2 мл физиологического раствора, ресуспензируют и подсчитывают количество лейкоцитов в камере Горяева. Затем лейкоцитарную взвесь разводят физиологическим раствором до концентрации клеток в 2 млн/мл.

Лейкоцитарную суспензию с концентрацией клеток 2 млн/мл вносят в лунки плоскодонного планшета по 100 мкл в лунку, в триплетах на каждого больного (в одной лунке – 200 тысяч клеток). После 60 минут инкубации при температуре 37°С надосадок забирают, а оставшийся клеточный монослой дважды отмывают физиологическим раствором.

Для определения содержания неферментных КБ к адгезированным на плашке и отмытым лейкоцитам добавляют 0,1% раствор зеленого прочного (100 мг зеленого прочного растворяют в 100 мл метанолового трис-буфера, рН 8,0-8,2) по 0,05 мл в лунку. После 30 минут инкубации при 37°С не фагоцитированный и не связанный с катионными белками краситель удаляют и дважды отмывают пробу физиологическим раствором. Внутриклеточно расположенный краситель растворяют диметилсульфоксидом (ДМСО), добавляя последний по 100 мкл в лунку. Затем измеряют оптическую плотность проб на иммуноферментном анализаторе Micro Reader 4 фирмы Hyperion (США) при длине волны 620 нм. Полученную цифру умножают на 100. Содержание неферментных КБ в фагоцитирующих клетках крови выражают в условных единицах (усл. ед.).

Для определения содержания МП в фагоцитах крови к адгезированным на плашке и отмытым лейкоцитам добавляют раствор ортофенилендиамина (ОФД) с перекисью водорода по 100 мкл в лунку. Последний получают, растворяя 4 мг ОФД в 10 мл фосфатно-цитратного буфера (рН 5,0) и добавляя 500 мкл 0,33% раствора перекиси водорода. После 10 минут инкубации при комнатной температуре реакцию останавливают добавлением 10% раствора серной кислоты по 100 мкл в лунку.

Оптическую плотность проб измеряют на иммуноферментном фотоэлектрическом анализаторе Lincey (Россия) при длине волны 492 нм. Полученное значение умножают на 100. Содержание МП в фагоцитирующих клетках крови выражают в усл.ед.

При содержании КБ в фагоцитах крови более 105 усл.ед. и нормальной и повышенной активности МП в клетках диагностируют саркоидоз органов дыхания в активной фазе. При содержании КБ в фагоцитах крови менее 105 усл.ед. и пониженной активности МП в клетках диагностируют активный туберкулез легких (таблица 1).

Пример 1

Больная Г., 23 лет, госпитализирована в клинику НИИ фтизиопульмонологии ММА им. И.М.Сеченова для проведения лечения. Туберкулезные изменения в легких выявлены в начале апреля 2003 года при флюорографическом обследовании. При поступлении состояние больной удовлетворительное, жалобы на небольшую слабость. Кожные покровы и видимые слизистые нормальной окраски, чистые. Периферические лимфоузлы не увеличены. Тоны сердца ясные, пульс ритмичный, 80 уд/мин. Артериальное давление 110/70 мм рт.ст. Грудная клетка обычной формы.

Перкуторно-легочный звук; аускультативно – дыхание везикулярное, хрипы не выслушиваются. Частота дыхательных движений 14 в минуту. Язык чистый, живот мягкий, при пальпации безболезненный. Печень не выступает из-под края реберной дуги. Общий анализ крови: СОЭ – 8 мм/ч; лейк. – 5,6·10⁹ л^-1; эр. – 4,5·10¹² л^-1; Нв – 132 г/л; эоз. – 1%; лимф. – 31%; мон – 9%; с/я – 59%; п/я – 1%.

Биохимические показатели крови в пределах нормальных значений.

Общий анализ мочи без патологии. В мокроте микобактерии туберкулеза (МБТ) не найдены.

Рентгенологически в S2 правого легкого определяются множественные очаги с нечеткими контурами, большинство из которых мелкие. На остальном протяжении правого легкого и в левом легком патологических изменений не выявлено.

Диагноз: очаговый туберкулез легких в фазе инфильтрации, МБТ – (не обнаружены).

При обследовании активность МП в фагоцитах крови – 27 усл.ед., содержание КБ – 76 усл.ед. Полученные данные (пониженная активность МП при КБ менее 105 усл.ед.) характерны для активного туберкулеза легких.

Пример 2

Больной С., 39 лет, в марте 2003 года перенес “острое респираторное заболевание”. При рентгенологическом обследовании выявлены изменения в легких. Для уточнения диагноза и лечения госпитализирован в клинику НИИ фтизиопульмонологии ММА им. И.М.Сеченова. При поступлении состояние относительно удовлетворительное, жалобы на редкий кашель, одышку при физической нагрузке. Кожные покровы и видимые слизистые нормальной окраски, чистые. Периферические лимфоузлы не увеличены. Тоны сердца ясные, пульс ритмичный, 76 уд/мин. Артериальное давление 120/80 мм рт.ст. Грудная клетка обычной формы. Перкуторно – легочный звук; аускультативно – дыхание везикулярное, хрипы не выслушиваются. Частота дыхательных движений 16 в минуту. Язык чистый, живот мягкий, при пальпации безболезненный. Печень не выступает из-под края реберной дуги. Общий анализ крови: СОЭ – 7 мм/ч; лейк – 7,5·10⁹ л^-1; эр. – 5,14·10¹² л^-1; Нв – 155 г/л; эоз. – 3%; лимф. – 27%; мон – 10%; с/я – 60%; п/я – 1%.

Биохимические показатели крови в пределах нормальных значений.

Общий анализ мочи без патологии.

Рентгенологически в обоих легких определяются немногочисленные средней интенсивности очаговоподобные тени с нечеткими контурами. Корни расширены за счет увеличения внутригрудных лимфатических узлов.

Бронхоскопия: компрессионная деформация трахеи и стенозы левого язычкового бронха и левого нижнедолевого бронха 1-3 ст. Произведена трансбронхиальная биопсия легкого. Морфологически верифицирован саркоидоз.

Диагноз: саркоидоз внутригрудных лимфатических узлов, легких, активная фаза.

При обследовании активность МП в фагоцитах крови 49 усл.ед., содержание КБ-119 усл.ед. Полученные данные (нормальные значения МП при КБ более 105 усл.ед.) характерны для активного саркоидоза органов дыхания.

Способ апробирован в клинике НИИ фтизиопульмонологии ММА им. И.М.Сеченова на 20 больных туберкулезом легких с процессами преимущественно продуктивного характера и торпидным течением заболевания и 34 больных саркоидозом органов дыхания в активной фазе без сопутствующих заболеваний (отличить саркоидоз от острых деструктивных форм туберкулеза легких не представляет затруднений). Результаты исследований представлены в таблице 2.

Использование предлагаемого метода с помощью одновременного измерения активности МП и содержания КБ в фагоцитирующих клетках крови позволяет в 33,3% случаев установить диагноз туберкулеза или саркоидоза органов дыхания, что повышает точность дифференциальной диагностики и упрощает ее. Метод диагностики, взятый в качестве прототипа, более сложен в техническом исполнении и требует наличия дорогостоящей аппаратуры (автоматизированная система для исследования хемилюминисценции “Люцифер-Б”). Кроме того, авторы не указывают в каком проценте случаев можно установить диагноз с помощью данного метода.

Своевременное установление диагноза дает возможность уменьшить неоправданно частую терапию ex juvantibus, начать адекватное специализированное лечение больного в максимально ранние сроки, что обеспечит повышение эффективности терапии, исключит развитие “второй” – ятрогенной болезни. Таким образом, своевременное установление диагноза больным туберкулезом и саркоидозом органов дыхания обеспечивает экономический эффект, повышая эффективность лечения. Предложенный способ может найти применение в клинической практике фтизиатрии и пульмонологии. Способ информативен, воспроизводим.

Формула изобретения

Способ дифференциальной диагностики туберкулеза и саркоидоза органов дыхания, включающий исследование биосубстрата, отличающийся тем, что определяют в фагоцитах крови содержание неферментных катионных белков (КБ) и активность миелопероксидазы (МП) и при содержании КБ более 105 усл.ед. и нормальной и повышенной активности МП диагностируют саркоидоз, а при содержании КБ менее 105 усл.ед и пониженной активности МП – туберкулез легких.