Патент на изобретение №2255086

(54) 1-МЕТИЛ-2-ФЕНИЛТИОМЕТИЛ-3-КАРБЭТОКСИ-4-ДИМЕТИЛАМИНОМЕТИЛ-5-ОКСИ-6- БРОМИНДОЛА МЕЗИЛАТ, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области фармацевтической химии, конкретно к новому соединению – мезилату 1-метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола и его гидратам. Указанная мезилатная соль превосходит по своей противовирусной активности остальные соли 1-метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола и может применяться в различных лекарственных формах. Изобретение расширяет арсенал средств для лечения вирусной инфекции. Новое противовирусное средство характеризуется высокой эффективностью лечения при низкой токсичности. 2 н.п. ф-лы, 6 табл.

Изобретение относится к области фармацевтический химии, конкретно к новому соединению – мезилату 1-метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола, имеющему следующую структурную формулу:

Задачей изобретения является получение новых химических соединений, обладающих широкой биологической активностью, в том числе противовирусной активностью, расширение арсенала средств для лечения вирусной инфекции, разработка нового препарата, характеризующегося высокой эффективностью лечения при низкой токсичности.

Известно большое количество противовирусных препаратов. Ацикловир, Фамцикловир и Ганцикловир применяются при лечении герпеса. Амантадин и Римантадин применяются для профилактики и лечения гриппа. Интерфероны нашли свое применение в лечении гепатитов.

В результате исследований было неожиданно обнаружено, что мезилат 1-метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола превосходит по своей противовирусной активности остальные соли 1-метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола.

Наиболее близким по сущности к заявляемому изобретению является гидрохлорид 1-метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола (Арбидол), широко применяемый для профилактики и лечения таких вирусных инфекций, как грипп и ОРВИ (Патент РФ №2008004).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

ПРИМЕР 1. Получение моногидрата 1-метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдоламезилата

Мезилатную соль 1-метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола получают следующим способом:

К раствору 16 г (0.03 моля) хлоргидрата моногидрата арбидола в 350 мл этанола прибавляют при 20°С и перемешивании 15 мл раствора этилата натрия в этаноле (из 2.3 г натрия и 50 мл спирта), перемешивают 2-3 мин и затем, не прекращая перемешивания, прибавляют при 20°С раствор 2.88 г (0.03 моля) метансульфокислоты в 35 мл этанола. Полученную смесь разбавляют вдвое водой, спирт отгоняют в вакууме, и из остатка кристаллизуют продукт в течение 12 часов при +4°С. Выпавшее вещество отфильтровывают, промывают на фильтре холодной водой два раза. Структура полученного соединения подтверждена спектром ЯМР (см. Таблицу №1)

ПРИМЕР 2. Получение безводного 1-метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдоламезилата

Кристаллы моногидрата мезилатной соли 1-метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола, в количестве 100 мг, полученные в Примере 1, растворяют в 1,3 мл диоксана при температуре 60-70°С и оставляют при комнатной температуре до выпадения кристаллов. Полученный осадок отфильтровывают, промывают 0,3 мл диоксана и высушивают в вакууме над Р₂O₅/КОН.

Продукт представляет собой бесцветный кристаллический порошок, tпл=170,5-171,5°С. Выход 72%.

Структура полученного соединения подтверждена спектром ЯМР (см. Таблицу №2, рис.1).

ПРИМЕР 3. Получение безводного 1-метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола мезилата в аморфном состоянии

Кристаллы моногидрата мезилатной соли 1-метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола, в количестве 60 мг, полученные в Примере 1, растворяют в 1,2 мл диметилсульфоксида при комнатной температуре и лиофилизуют в высоком вакууме, используя охлаждаемый СО₂ “палец”. Получают аморфное вещество белого цвета, не содержащее воды, с tпл.=170,5-171,5°С.

ПРИМЕР 4. Получение “четверть”-гидрата 1-метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола мезилата

Гидраты 1-метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола мезилата различного состава могут быть получены путем перекристаллизации моногидрата 1-метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола мезилата, из смесей C₂H₅0H/(C₂H₅)₂O при изменении соотношения спирт/эфир. В качестве примера приводится получение гидрата мезилатной соли 1-метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола, в котором на 4 моля соли приходится 1 моль воды.

Кристаллы моногидрата мезилатной соли 1-метил-2-фенилтиометил-З -карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола, в количестве 101 мг, полученные в Примере 1, растворяют в 1,0 мл абсолютного этилового спирта при температуре 60°С, охлаждают до комнатной температуры и прибавляют 8 мл этилового эфира порциями по 2 мл. Полученный осадок отфильтровывают, промывают 2 мл этилового эфира и высушивают в вакууме над P₂O₅/KOH. Продукт представляет собой бесцветные кристаллы. При нагревании до t=120-121°С, происходит изменение физического состояния кристаллического порошка, вызванное отщеплением молекул воды. Далнейшее нагревание вызывает плавление полученных кристаллов, tпл=170,5-171,5°С. Выход 91%. Структура полученного соединения подтверждена спектром ЯМР (см. Таблицу №3).

ПРИМЕР 5. Противовирусное действие 1-метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола мезилата в отношении вируса тяжелого острого респираторного синдрома (ТОРС), штамм СоД, на культуре клеток (VERO-Е6)

Испытание профилактического действия препарата.

Во всех примерах, касающихся исследования противовирусного действия арбидола, используется моногидрат 1-метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола мезилата.

Из пробирок с монослоем клеток удаляли ростовую среду и вносили в опытные пробирки по 1,0 мл поддерживающей среды, содержащей различные концентрации исследуемых препаратов. Через 4 часа инкубирования при температуре 37,0°С питательную среду сливали и в пробирки вносили по 0,1 мл суспензии вируса ТОРС, с концентрацией 0,001-0,004 БОЕ на клетку. Контакт вируса с клетками – 60 минут при 37,0°С. После этого вирус из пробирок удаляли, инфицированные клетки промывали средой ПС, затем в опытные и контрольные пробирки добавляли по 1,0 мл поддерживающей среды ПС, содержащей 2,5% сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС). Использовали по 4 пробирки на каждую концентрацию препарата.

Дополнительные контроли:

а) контроль культур клеток – в 4 пробирки вносили по 1,0 мл поддерживающей среды,

б) контроль дозы вируса – в 4 пробирки вносили по 0,1 мл суспензии вируса ТОРС и через 60 минут инкубирования после удаления вируссодержащей суспензии добавляли 1,0 мл поддерживающей среды.

Испытание лечебно-профилактического действия препарата

Из пробирок с монослоем клеток удаляли ростовую среду и вносили по 0,1 мл суспензии вируса ТОРС, с концентрацией 0,001-0,004 БОЕ (бляшкообразующая единица) на клетку. Контакт вируса с клетками продолжительностью 60 минут.

После удаления вируса клетки промывали средой ПС с 2,5% сыворотки КРС и добавляли поддерживающую среду, содержащую различные дозы препарата. Инкубирование клеток осуществляли при температуре 37,0°С.

Через 72 часа после заражения инфицированные клетки механически разрушали, объединяли в одну пробу и затем десятикратными разведениями инфицировали монослойные культуры клеток во флаконах с последующим нанесением агарового покрытия для оценки уровня накопления вируса методом негативных колоний.

Учет формирования негативных колоний осуществляли через 72 часа после инфицирования. Результаты оценивали по подавлению продукции вируса в культуре клеток в присутствии различных доз оцениваемых препаратов.

Противовирусная эффективность 1-метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола мезилата в отношении вируса ТОРС в культуре клеток VERO-E6 представлена в Таблице 4.

Таблица №4
Препа рат	Доза препарата,	Схема внесения препарата	Уровень накопления возбудителя, lg БОЕ /мл	Подавление репродукци и вируса, , lg	Коэффициент ингибирова ния, процент
Мезилат	15,0	За 4 часа до инфицирования	5,6	1,0	90,0
		После инифицирования	5,7	0,9	87,5
Арбидол	50,0	За 4 часа до инфицирования	5,9	0,7	79,5
		После инифицирования	6,0	0,6	77,7
Риба вирин	50,0	За 4 часа до инфицирования	6,0	0,6	77,7
		После инифицирования	5,0	1,6	97,5
Контроль дозы вируса			6,6	0

Антивирусная активность 1-метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола мезилата и препаратов сравнения

Профилактическое и лечебное действие препаратов.

Профилактическая и лечебная эффективность препаратов определяемая по разнице накопления возбудителя ТОРС в опытных и контрольных культурах, представлена в таблице 4. Мезилат обладал практически одинаковой эффективностью в отношении вируса ТОРС по сравнению с арбидолом и рибавирином в дозах, которые в 3, 3 раза меньше, чем у препаратов сравнения. Максимальная эффективность 1-метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола мезилата составила 90% при внесении его за 4 часа в поддерживающую среду до инфицирования клеток.

ПРИМЕР 6. Противовирусное действие 1-метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола мезилата в отношении вируса тяжелого острого респираторного синдрома (ТОРС), штамм СоД, на экспериментальной модели (сирийские хомячки)

Животные: сирийские хомячки массой от 60 до 80 г, поставленные из питомника Вирусологического центра НИИМ МО РФ (г. Сергиев Посад)

Вирус возбудителя тяжелого острого респираторного синдрома – штамм СоД из музея Вирусологического центра НИИМ МО РФ; инокулят – суспензия культуры клеток VERO-E6, предварительно инфицированных возбудителем ТОРС.

Препараты: препарат сравнения, прототип, субстанция; новый препарат-1-метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола мезилат, субстанция. Препараты вводили перорально. Препараты разводили на физиологическом растворе с добавлением ДМСО (0,01-0,005%).

Оценка эффективности препаратов: по снижению уровня накопления возбудителя в легких, нормализации уровня аминотрансфераз и лейкоцитов в крови опытных животных по сравнению с контрольными группами.

Результаты исследования. Сравнительная оценка противовирусной эффективности 1-метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола мезилата и препарата сравнения – арбидола. Результаты представлены в таблице 5, из которых следует, что введение препарата по лечебно-профилактической схеме способствует снижению уровня накопления вируса в легких на 2,1 lg БОЕ, способствует снижению активности аминотрансфераз в крови и нормализует уровень лейкоцитов.

Мезилат обладает выраженной противовирусной эффективностью против возбудителя ТОРС. При этом используется доза препарата в 2 раза меньшая, чем препарата сравнения. В отличие от используемого для лечения данной инфекции рибавирина эффективности 1 -метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола мезилата малотоксичен.

Таблица №5 Оценка эффективности препаратов на нелетальной модели – сирийских хомячках по изменению уровня накопления вируса ТОРС в легких биохимическим и гематологическим показателям крови
Препарат	Доза, мг/кг	Схема введения	Снижение накопления вируса в легких, lg	Активность аминотрансфераз в сыворотке крови, мМ/ч.л.		Уровень лейкоцитов в крови, мкл*103
				АлАТ	АсАТ
Мезилат	30,0	-24,-1,+24,4-48	2,1	0,42	0,39	7,4
Арбидол	60,0	-24,-1,+24,+48	2,1	0,44	0,41	4,8
Рибавирин	80,0	+24 и далее 6 суток	1,4	0,40	0,25	6,9
Контроль дозы				2,17	1,58	12,8
Контроль стада				0,41	0,30	6,2

Примечание: заражающая доза 5,0 lg БОЕ при пероральном использовании.

ПРИМЕР 7. Противовирусное действие 1-метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола мезилата в отношении вируса везикулярного стоматита, штамм Индиана, на культуре клеток (VERO-E6).

Испытание профилактического и лечебного действия.

Из пробирок с 3 суточным монослоем клеток удаляли ростовую среду и вносили в опытные пробирки по 1,0 мл поддерживающей среды, содержащей различные концентрации исследуемых препаратов. Через 4 часа инкубирования при температуре 37,0°С питательную среду сливали и в пробирки вносили по 0,1 мл суспензии вируса везикулярного стоматита в разведениях от 10^-3 до 10^-7. Контакт вируса с клетками -60 минут при 37,0°С. После этого вирус из пробирок удаляли, инфицированные клетки промывали средой ПС, затем в опытные и контрольные пробирки добавляли по 1,0 мл поддерживающей среды ПС, содержащей 2,5% сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС). Использовали по 4 пробирки на каждое разведение вирусной суспензии.

Пробирки с культурами клеток инкубировали в течение 48 часов при температуре 37,0°С.

Дополнительные контроли:

а) контроль культуры – в 4 пробирки вносили по 1,0 мл поддерживающей питательной среды,

б) контроль дозы вируса – в 4 пробирки вносили по 0,1 мл суспензии вируса везикулярного стоматита и через 60 минут инкубирования после удаления вируссодержащей суспензии добавляли 1,0 мл поддерживающей среды.

Результаты.

При использовании препарата во всех экспериментах зафиксировано снижение ЦПД₅₀ вируса везикулярного стоматита от 2,0 до 0,5 lg. При внесении 25,0 мкг/мл препарата после заражения выявлен выраженный лечебный эффект, чего не наблюдалось у препарата сравнения – арбидола. Противовирусная эффективность 1-метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола мезилата в отношении вируса везикулярного стоматита в 5 раз превосходит эффективность арбидола. Так, при концентрации 5,0 мкг/мл мезилата подавление репликации возбудителя соответствует 25,0 мкг/мл арбидола.

Таблица №6 Эффективность препаратов арбидола, 1-метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола мезилата и рибавирина в отношении вируса везикулярного стоматита в культуре клеток VERO-E6
Препарат	Доза препарата, мкг/ мл	Схема применения препарата	Подавление репликации возбудителя, , lg ЦПД50
Арбидол	25,0	За 4 часа до заражения	0,75
		За 15 минут до заражения	1,25
		После заражения	0,75
	12,5	За 4 часа до заражения	0,45
		За 15 минут до заражения	0,67
		После заражения	0,37
Мезилат	25,0	За 4 часа до заражения	2,0
		За 15 минут до заражения	1,75
		После заражения	1,75
	15,0	За 4 часа до заражения	1,75
		За 15 минут до заражения	1,0
		После заражения	0,75
	5,0	За 4 часа до заражения	0,5
		За 15 минут до заражения	0,75
		После заражения	1,25
Рибавирин	50,0	За 4 часа до заражения	1,0
		За 15 минут до заражения	1,5
		После заражения	1,25
	15,0	За 4 часа до заражения	0,75
		За 15 минут до заражения	0,50
		После заражения	0,75

Таким образом, в экспериментах на культуре клеток VERO-E6 выявлено выраженное вирусингибирующее действие 1-метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола мезилата в концентрациях 15 мкг/мл и выше в отношении вируса везикулярного стоматита.

ПРИМЕР 8. Получение фармацевтической композиции для приготовления таблетной массы

Готовят смесь, состоящую из 10 г моногидрата арбидола мезилата; 4,5 г крахмала картофельного; 0,25 г метилцеллюлозы; 0,15 г кальция стеарата; 0,10 г кислоты стеариновой. Полученную после перемешивания массу используют для таблетирования.

ПРИМЕР 9. Получение фармацевтической композиции для приготовления раствора для инъекций

К 100 мл готового раствора 0,9% хлорида натрия при перемешивании добавляют 1 г моногидрата арбидола мезилата. Полученный раствор отфильтровывают. Готовый продукт ампулируют и используют для внутримышечных и внутривенных инъекций.

Мезилат 1-метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола может применяться в различных лекарственных формах, в том числе с использованием фармацевтических носителей, принятых в фармацевтической химии для приготовления средства доставки активного компонента в организм пациента.

Формула изобретения

1. 1-Метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола мезилат и его гидраты, обладающие противовирусной активностью.

2. Фармацевтическая композиция, обладающая противовирусной активностью, содержащая 1-метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола мезилат в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.

PC4A – Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение

(73) Патентообладатель(и):

Закрытое акционерное общество “Мастерклон”

(73) Патентообладатель:

“БЛЭК БЁРД ИНВЕСТМЕНТ ЭНТЕРПРАЙЗИС КОРП.” (VG)

Дата и номер государственной регистрации перехода исключительного права: 11.10.2006 № РД0013046

Извещение опубликовано: 20.11.2006 БИ: 32/2006

PC4A – Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение

(73) Патентообладатель(и):

БЛЭК БЁРД ИНВЕСТМЕНТ ЭНТЕРПРАЙЗИС КОРП. (VG)

(73) Патентообладатель:

Открытое акционерное общество “Фармстандарт”

Дата и номер государственной регистрации перехода исключительного права: 21.03.2008 № РД0034206

Извещение опубликовано: 10.05.2008 БИ: 13/2008