Патент на изобретение №2254709

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОПРОДУКТИВНЫХ РАСТЕНИЙ- САМООПЫЛИТЕЛЕЙ НА ОСНОВЕ ЭФФЕКТА ЗАКРЕПЛЕННОГО ГЕТЕРОЗИСА

(57) Реферат:

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности селекции растений. Подбирают родительские формы по гетерозису, на основе гибридологического анализа по наличию гомозиготных полулетальных мутаций в F₂ у одной из родительских форм. Далее проводят скрещивание, отбирают гибриды по гетерозису, оценивают и размножают гомозиготные формы с максимальным ККГ-эффектом. До проведения отбора формируют морфологическую ККГ-модель путем проведения подробного морфологического описания растений F₁, полученных от скрещивания подобранных родителей, для выявления ККГ-эффекта по данной полулетальной мутации, а отбор гибридов по гетерозису осуществляют путем выделения в F₂ растения с признаками ККГ-модели и высева семян каждого отобранного растения на индивидуальной делянке. В F₃ и F₄ отбор проводят аналогичным способом, как в F₂, а в F_5, выделяют гомозиготные по селектируемым признакам формы с максимальным ККГ-эффектом. Способ позволяет получить высокожизнеспособные формы растений-самоопылителей и тем самым повысить продуктивность создаваемых сортов у самоопыляющихся культур. 1 ил., 3 табл.

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано в селекции растений.

Известно, что гетерозис – свойство гибридов превосходить по определенным признакам лучшую из родительских форм. Максимально проявляется оно в первом поколении гибридов, а в последующих – постепенно затухает. Закрепить его в потомстве ученым-селекционерам долго не удавалось. Впервые метод закрепления гетерозиса в потомстве был разработан на тутовом шелкопряде. Генетические же закономерности возникновения и затухания гетерозиса в потомстве растений такие же, как и у животных. Поэтому известные способы закрепления гетерозиса на животных объектах (на тутовом шелкопряде) могут быть использованы в качестве аналогов для растительных объектов.

Известен способ селекции тутового шелкопряда, включающий использование в качестве родителей форм с полулетальными мутациями, длительного инбридинга (инцухта), отбора из инбредных линий высоко жизнеспособных форм, несущих полулетальный ген l, который нейтрализован комплексом скоординировано действующих компенсационных генов (ККГ), вовлечения таких форм в гибридизацию, оценки их общей (ОКС) и специфической (СКС) комбинационной способности и отбора инбредных форм с высокой ОКС и СКС, обеспечивающих мощный гетерозис за счет положительного аддитивного действия ККГ на жизнеспособность организмов типа l/+ на фоне гетерозиготного подавления негативного эффекта полулетальных генов (Струнников В.А. Новая гипотеза гетерозиса и ее научное и практическое значение. Вестник с.-х. науки, 1983, №1(316), С.34-40).

Недостатком известного способа является то, что увеличение продуктивности организмов за счет мощного проявления гетерозиса обеспечивается только в первом гибридном поколении F₁. В последующих поколениях наблюдается уменьшение эффекта гетерозиса за счет перехода полулетальных генов в гомозиготное (l) состояние, а также нарушения координации ККГ вплоть до его полного распада за счет последующего внутрипопуляционного неконтролируемого перекрестного скрещивания. При выведении линий с высокой комбинационной способностью на основе ККГ требуется длительный период времени, обусловленный необходимостью проведения нескольких беккроссных скрещиваний для выведения из генома полулетальных генов и последующего перевода беккроссной линии в гомозиготное состояние по нормальному (+) аллелю стандартными способами. В целом, использование известного способа селекции с длительными периодами отбора высокожизнеспособных инбредных линий и многократным беккроссированием пригодно только для организмов, имеющих короткие циклы онтогенетического развития и дающих несколько поколений в год, и существенно ограничивает его применение в селекции растений, дающих одну генерацию в год. Промышленное использование гибридов F_1, полученных известным способом, возможно только на перекрестие опыляющихся видах растений.

Известен также способ закрепления основанного на ККГ-эффекта гетерозиса в последующих поколениях организмов. Для этого подбором родительских форм получают высокогетерозисные гибриды, от которых получают серию абсолютно гомозиготных потомков методом моноспермического андрогенеза. У растений абсолютные гомозиготы получают путем стимулирования эмбрионального развития гаплоидной пыльцы с последующим превращением ее зародышевых клеток в диплоидные, развивающиеся в жизнеспособные фертильные растения. После 5-6 беккроссов абсолютно гомозиготных особей с исходным гибридом очищенный от полулетальных генов гибрид массово размножают путем внутривидового скрещивания. При этом достигается почти полное удаление леталей и полулеталей из генотипа, в то же время сохраняется часть генов, обеспечивающих гетерозис в исходном гибриде (Струнникова Л.В. Струнников В.А. Способ закрепления гетерозиса гибридов в последующих поколениях. Патент РФ №2153253, А 01 К 67/00, 67/04).

Недостатком известного способа, взятого в качестве прототипа, является то, что для сохранения гетерозиса в ряду последовательных поколений необходимо проведение 5-6 беккроссов полученных гибридов с их абсолютно гомозиготными потомками (сыновьями). Для выведения абсолютно гомозиготных потомков требуется наличие метода их получения, основанного на моноспермическом андрогенезе. При этом у тутового шелкопряда неосемененных самок любой породы облучают -лучами в дозе 80 кр. Затем самки спариваются с самцами индивидуальных гибридов. Отложенные яйца в возрасте 60-80 минут после откладки при температуре 25°С прогревают 210 минут в воде, нагретой до 38°С. При этом абсолютные гомозиготы в подавляющем большинстве погибают на разных стадиях развития. Выживают только те гомозиготы, которым в ходе мейоза не досталось совсем или досталось очень мало вредных генов, в основном, слабого действия. У растений абсолютные гомозиготы получают путем стимулирования эмбрионального развития гаплоидной пыльцы с последующим превращением ее зародышевых клеток в диплоидные, развивающиеся в жизнеспособные фертильные растения. В целом применение известного способа, выбранного в качестве прототипа, существенно ограничивает выведение высокопродуктивных форм из-за обязательного включения в селекционный процесс андрогенетических потомков и длительного процесса беккроссирования. При этом успешный моноспермический андрогенез известен только у ограниченного числа видов растений и требует применения ряда последовательных биотехнологических операций с культурой пыльников, а многократные беккроссы с оценкой по потомству требуют длительного времени. Кроме этого, промышленное использование форм с закрепленным гетерозисом, полученных известным способом, возможно только на перекрестие опыляющихся видах растений.

Задача, решаемая изобретением, состоит в повышении продуктивности растений-самоопылителей за счет использования суммарного эффекта комплекса компенсирующих генов (ККГ-комплекса) на фоне отсутствия ККГ-образующей полулетальной мутации в гомозиготном потомстве.

Цель изобретения – передача от родительской формы растения-самоопылителя, несущего полулетальную мутацию, накопленного в филогенезе блока коадаптированных генов ККГ-комплекса и закрепление его в гомозиготном потомстве.

Технический эффект достигается тем, что в известном способе закрепления гетерозиса гибридов в последующих поколениях, включающем подбор родительских форм по гетерозису, определяемому большим количеством скоординированных в своем действии благоприятных генов (ККГ-комплексом), их скрещивание, отбор гибридов по гетерозису, оценку и размножение гомозиготных форм с максимальным ККГ-эффектом, согласно изобретению подбор родительских форм осуществляют на основе гибридологического анализа по наличию гомозиготных полулетальных мутаций в F₂ у одной из родительских форм, формируют морфологическую ККГ-модель путем подробного морфологического описания растений F₁, полученных от скрещивания подобранных родителей, для выявления ККГ-эффекта по данной полулетальной мутации, а отбор гибридов по гетерозису осуществляют следующим образом: в F₂ выделяют растения с признаками морфологической ККГ-модели и высевают семена каждого отобранного растения на индивидуальной делянке, в F₃ и F₄ поступают также, как и в F₂, а в F₅ выделяют гомозиготные по селектируемым признакам формы с максимальным ККГ-эффектом.

Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый способ отличается от известного наличием новой операции (формирование морфологической ККГ-модели путем подробного морфологического описания растений F₁, полученных от скрещивания подобранных родителей, для выявления ККГ-эффекта по данной полулетальной мутации), а также порядком выполнения известной операции “подбор родительских форм” (эту операцию осуществляют не подбором родителей, обеспечивающих наиболее высокогетерозисные гибриды, как это изложено в прототипе, а на основе гибридологического анализа по наличию гомозиготных полулеталей в F₂) у одной из родительских форм, и порядком выполнения известной операции “отбор гибридов по гетерозису”: в прототипе эту операцию осуществляют путем сравнительных испытаний серии индивидуальных гибридов и выбором 10 лучших по гетерозису индивидуальных гибридов, а в заявляемом способе по другому: в F₂ выделяют растения с признаками морфологической ККГ-модели и высевают семена каждого отобранного растения на индивидуальной делянке, в F₂ и F₃ поступают так же, как и в F₂, а в F₅ выделяют гомозиготные по селектируемым признакам формы с максимальным ККГ-эффектом. Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию патентоспособности “НОВИЗНА”.

Исследуя уровень техники в процессе проведения патентного поиска по всем видам сведений, общедоступных в печати, обнаружили, что способ получения высокопродуктивных растений-самоопылителей с использованием эффекта закрепленного гетерозиса, включающий заявленную совокупность признаков, для специалиста в области селекции явным образом не следует из известного на сегодня существующего уровня техники.

Исследованиями на протяжении ряда лет установлено, что геномы живых организмов, в том числе геномы растений-самоопылителей в филогенезе, подвергаются постоянному воздействию как естественных, так и антропогенных мутагенных факторов и накапливают мутации. Подавляющее большинство мутаций оказывает негативный эффект в онтогенезе. Полулетальные и субвитальные мутации, не затрагивающие существенно репродуктивные функции организма, за счет горизонтального переноса генов и рекомбинационных процессов в мейозе способствуют постепенному накоплению доминантных и полудоминантных генов, компенсирующих негативный эффект мутаций. Компенсационный эффект сложившихся блоков коадаптированных генов ККГ-комплекса пропорционален вредоносности мутации; как правило, направлен на улучшение экспрессии признаков, подавляемых мутацией, и наиболее выражен у организмов – носителей полулетальных мутаций. В ряде случаев ККГ-комплекс полностью нейтрализует негативный эффект полулетальной мутации, при этом генотипы, несущие нейтрализованную ККГ-комплексом мутацию, могут быть визуально и морфологически неотличимы от здоровых организмов. При расщеплении гибридов, образовавшихся с участием родительских генотипов – источников ККГ-комплексов, образуются генотипические классы с отсутствием полулетальной мутации и наличием активных полимерных компонентов исходного ККГ-комплекса, обеспечивающим сохраняющийся в ряду поколений гетерозис (ККГ-эффект). В таких генотипах при отсутствии вредной мутации компенсирующий эффект коадаптированного блока генов ККГ-комплекса или его сцеплено наследуемых активных компонентов реализуется в положительном аддитивном воздействии на весь организм, повышая его общую жизнеспособность и улучшая его морфологические показатели. Гомозиготные гибридные генотипы – носители ККГ-комплекса (ККГ-линии), отличающиеся улучшенными хозяйственно-ценными признаками, могут использоваться как в качестве исходного материала при селекции растений, так и в качестве полноценных сортов. На основании вышеизложенного можно сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию патентоспособности “ИЗОБРЕТАТЕЛЬСКИЙ УРОВЕНЬ”.

Заявляемое техническое решение соответствует и критерию патентоспособности “ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ”, так как оно может быть использовано в сельском хозяйстве, и, кроме того, в описании изобретения представлены средства и методы, с помощью которых возможно осуществление технического решения в том виде, как оно охарактеризовано в формуле изобретения.

Способ осуществляют следующим образом. Начинают с подбора родительских форм по гетерозису, определяемому большим количеством скоординированных в своем действии благоприятных генов (ККГ-комплекса). Наличие скомпенсированной полулетали в геноме определяют гибридологическим методом по наличию в F₂ гомозигот по полулетальной мутации у одной из родительских форм. При этом в качестве другого родителя берут любую генетически неродственную форму того же вида с диким (не мутантным) аллелем по месту полулетальной мутации первого родителя и отсутствием экспрессии ККГ-эффекта.

Проводят скрещивание подобранных родительских форм любым известным способом.

Формируют морфологическую ККГ-модель путем подробного морфологического описания растений F₁, полученных от скрещивания подобранных родителей, для выявления ККГ-эффекта по данной полулетальной мутации.

Отбор гибридов по гетерозису осуществляют следующим образом: в F₂ выделяют растения с признаками морфологической ККГ-модели и высевают семена каждого отобранного растения на индивидуальной делянке. В F₃ и F₄ поступают так же, как и в F₂. А в F₅ выделяют гомозиготные по селектируемым признакам формы с максимальным ККГ-эффектом.

Выделенные гомозиготные формы с максимальным ККГ-эффектом оценивают по стандартным методикам и размножают.

Пример осуществления способа.

Были проанализированы расщепляющиеся популяции гибридных комбинаций сои за предыдущие 10 лет (всего около 700 комбинаций) и выделены родительские формы, у которых в F₂ выщеплялись полулетальные растения. Таким образом, в качестве предполагаемых источников ККГ-комплексов были выделены сортообразцы сои Фора и Т-245 типа ll,Ccg₁Ccg₁, (где l – полулетальная мутация; Ccg₁ – исходный комплекс компенсационных генов), которые были взяты в качестве исходных форм для последующего гибридологического анализа.

Выделенные сортообразцы сои Фора и Т-245 были вовлечены в скрещивания с набором из 3-х сортов, не имеющих в своих геномах полулетальных мутаций (табл.1). За нулевую гипотезу принимали дигенное расщепление с полным доминированием и сцепленным наследованием активных компонентов ККГ-комплекса с соотношением фенотипических классов 9:3:3:1. При этом частота встречаемости рецессивных полулеталей теоретически должна составлять 1/16, а частота встречаемости растений без видимых признаков полулетальности – 15/16.

Анализ типов феноклассов в расщепляющейся популяции F₂ выявил наличие полулетальных растений при скрещивании сортов Фора и Т-245 со всеми сортами. При скрещивании контрольного сорта Астра были обнаружены только единичные растения полулетального морфотипа.

Гибридологический анализ частот фенотипических классов показал, что во всех гибридных комбинациях с участием сортов Фора и Т-245 обнаруживается близкое к 15:1 соотношение фенотипически нормальных и полулетальных растений. Более низкие, по сравнению с теоретическими, фактические значения ² свидетельствуют о справедливости нулевой гипотезы при 0,05 уровне значимости.

Таким образом, в геноме сортов сои Фора и Т-245 было подтверждено наличие полулетальных мутаций, а отсутствие у них видимых признаков снижения жизнеспособности или угнетения свидетельствовало о наличии активного ККГ-комплекса, эффективно нейтрализующего полулетальную мутацию.

Сорта сои Фора и Т-245 в качестве источников ККГ-комплексов были скрещены с неродственными сортами сои того же вида (с генотипами типа ++,00, где + – дикий (не мутантный) аллель, а 0 – отсутствие ККГ-комплекса), адаптированными к условиям произрастания в зоне осуществления селекции.

В поколении F₁ исходная рецессивная гомозиготная мутация ll перешла в гетерозиготное состояние l+ и фенотипически не проявлялась, а одинарный, но скоординированный блок генов ККГ-комплекса оказал аддитивное положительное влияние на весь гибридный организм, обеспечивая повышенную жизнеспособность (мощный гетерозис). Исследовали и описали фенотип растений F₁ типа l+,Ccg₁0 с одинарной дозой ККГ-комплекса, который в дальнейшем послужил морфологической моделью для оценки экспрессии активных компонентов коадаптированного блока генов данного ККГ-комплекса при отборе форм типа ++,ccg₂ccg₂ (где ccg₂ – сцеплено наследуемые компоненты ККГ-комплекса) (Фиг.1).

Полученные семена F₁ высевали отдельными делянками по комбинациям в оптимальные для культуры сроки. Рядом на отдельных рядках выращивали растения обоих родительских сортов. В течение вегетации проводили фенологические наблюдения. В фазу физиологической спелости семян гибридных растений F₁ проводили биометрические измерения, определяя высоту растений, количество узлов, бобов, семян, массу 1000 семян. Эти же параметры определяли у родительских сортов (табл. 2).

Как следует из анализа данных табл. 2, экспрессия одинарной дозы ККГ-комплекса растений F₁ на фоне подавленной в гетерозиготе полулетали заключалась в трансгрессивном увеличении высоты растений, количества узлов на главном стебле и большем количестве семян. Эти параметры составили основу морфологической ККГ-модели по данной гибридной комбинации.

Все полученные на растениях F₁ семена F₂ высевали на следующий год отдельными делянками по комбинациям. В фазу физиологической спелости растений в расщепляющихся комбинациях F₂ проводили морфологическую оценку по основным параметрам сформированной в пределах гибридной комбинации морфологической ККГ-модели.

В расщепляющейся гибридной популяции F₂ выделяли следующие фенотипические классы:

– гомозиготы по полулетали типа 11,00 полулетального фенотипа;

– трансгрессивные (гетерозисные) гибридные формы фенотипического класса + -ccg₂-, близкие по морфотипу к эталонным растениям F₁, у которых присутствовали активные компоненты ККГ-комплекса и отсутствовала ККГ-образующая полулеталь;

– гибридные формы – носители как полулетали, так и элементов ККГ-комплекса фенокласса ll,ccg₂-, а также гибридные формы с отсутствием ККГ-комплекса фенокласса + -00, норма реакции которых не выходила за крайние значения соответствующих признаков обеих родительских форм.

В гибридной популяции F₂ дигенное расщепление по признакам полулетальности и ККГ-эффекта должно образовывать фенотипические классы: + -,ccg₂-; ll,ccg₂ -; +-,00 и ll,00 в соотношении 9:3:3:1. Однако из-за морфологической схожести и непрерывной изменчивости морфологических признаков с нормой реакции в пределах крайних значений соответствующих признаков обеих родительских форм феноклассы ll,ccg_2-, и + -,00 были объединены в одну группу с теоретической частотой (3/16+3/1 б)=37,5%. Таким образом, в расщепляющейся гибридной популяции F₂ выделяли, подсчитывали и оценивали по модельным признакам растения следующих 3-х фенотипических классов: гомозиготы по полулетали полулетального фенотипа; трансгрессивные гибридные формы фенокласса, близкие по морфотипу к ККГ-модели; гибридные формы феноклассов ll,ccg_2-, и +-,00 (табл. 3).

Как следует из табл. 3, выделение в F₁ морфологических признаков для описания ККГ-модели по данной комбинации оказалось эффективным при отборе ККГ-форм в F₂. Это позволило разделить все растения F₂ в этой комбинации на 3 морфологически различающиеся группы. Все полулетальные растения типа ll,00, а также гибридные формы фенотипических классов ll,ccg₂-, и +-,00 выбраковывали. Растения фенокласса +-,ccg₂-, с положительными трансгрессиями по признакам ККГ-модели, составившие в гибридной комбинации Фора × Юг-30 53,0-58,7% от общего числа анализируемых растений, были пересеяны для получения следующего F₃ поколения.

В гибридных поколениях F₃-F₄ повторяли процедуру визуальной и морфологической оценки растений, отбирая трансгрессивные растения фенокласса +-,ccg₂-, и выбраковывая гибридные формы феноклассов ll,00; ll,ccg₂– и + -, 00. Потомство отобранных в F₄ ККГ-растений высевали на индивидуальных делянках для их оценки на генетическую однородность.

В F₅ отбирали нерасщепляющиеся ККГ-линии типа ++,ccg₂ccg₂ с положительными трансгрессиями по основным хозяйственно-ценным признакам. Отобранные ККГ-линии оценивали по продуктивности и другим хозяйственно-ценным признакам по стандартным методикам. Лучшие по продуктивности и другим хозяйственно-ценным признакам ККГ-линии размножали стандартными методами для промышленного использования.

Данный способ применим для создания высокопродуктивных растений у любых других самоопыляющихся культур.

Подбор родительских форм на основе гибридологического анализа по наличию гомозиготных полулетальных мутаций в F₂ у одной из родительских форм обеспечивает подтверждение наличия в их геноме полулетальных мутаций, а отсутствие у исходных сортообразцов видимых признаков снижения жизнеспособности свидетельствует о наличии эффективно нейтрализующего полулетальные мутации ККГ-комплекса. Такие сортообразцы могут использоваться как источники ККГ в последующих скрещиваниях, обеспечивая, таким образом, передачу от родительской формы растения-самоопылителя, несущего полулетальную мутацию, накопленного в филогенезе блока коадаптированных генов ККГ-комплекса и, в конечном итоге, повышение продуктивности растений-самоопылителей за счет использования суммарного эффекта комплекса компенсирующих генов (ККГ-комплекса) на фоне отсутствия ККГ-образующей полулетальной мутации в гомозиготном потомстве.

Формирование морфологической ККГ-модели путем подробного морфологического описания растений F₁, полученных от скрещивания подобранных родителей для выявления ККГ-эффекта по данной полулетальной мутации, обеспечивает выявление экспрессии одинарной дозы ККГ-комплекса в F₁ на фоне подавленной в гетерозиготе полулетали и определение параметров, составляющих основу морфологической ККГ-модели по данной гибридной комбинации.

Отбор гибридов по гетерозису заявленным путем, т.е. когда в F₂ выделяют растения с признаками морфологической ККГ-модели, обеспечивает разделение гибридной популяции на морфологически различающиеся феногруппы, обеспечивая, таким образом передачу от родительской формы растения-самоопылителя, несущего полулетальную мутацию, накопленного в филогенезе блока коадаптированных генов ККГ-комплекса. Высев семян каждого отобранного растения с признаками морфологической ККГ-модели на индивидуальной делянке осуществляют для получения следующего F₃ поколения с признаками морфологической ККГ-модели.

Проведение такого же отбора растений с ККГ-эффектом в F₃ и F₄, как и в F₂, обеспечивает последовательное освобождение гибридной популяции от носителей полулетальных мутаций и увеличение доли растений с выраженным ККГ-эффектом, таким образом обеспечивая закрепление накопленного в филогенезе блока коадаптированных генов ККГ-комплекса в гомозиготном потомстве и повышение продуктивности растений-самоопылителей.

Выделение в F₅ гомозиготных по селектируемым признакам форм с максимальным ККГ-эффектом обеспечивает получение исходных ККГ-линий для проведения дальнейших оценок и передачи их в качестве сортов на государственное сортоиспытание, обеспечивая закрепление накопленного в филогенезе блока коадаптированных генов ККГ-комплекса в гомозиготном потомстве. Таким образом, обеспечивается повышение продуктивности растений-самоопылителей за счет использования суммарного эффекта комплекса компенсирующих генов (ККГ-комплекса) на фоне отсутствия ККГ-образующей полулетальной мутации в гомозиготном потомстве.

Таким образом, заявляемым изобретением обеспечивается достижение поставленной цели и решение поставленной задачи.

Формула изобретения

Способ получения высокопродуктивных растений-самоопылителей с использованием эффекта закрепленного гетерозиса (ККГ-эффекта), включающий подбор родительских форм по гетерозису, определяемому большим количеством скоординированных в своем действии благоприятных генов (ККГ-комплекса), их скрещивание, отбор гибридов по гетерозису, оценку и размножение гомозиготных форм с максимальным ККГ-эффектом, отличающийся тем, что подбор родительских форм осуществляют на основе гибридологического анализа по наличию гомозиготных полулетальных мутаций в F₂ у одной из родительских форм, формируют морфологическую ККГ-модель путем подробного морфологического описания растений F₁, полученных от скрещивания подобранных родителей, для выявления ККГ-эффекта по данной полулетальной мутации, а отбор гибридов по гетерозису осуществляют следующим образом: в F₂ выделяют растения с признаками морфологической ККГ-модели и высевают семена каждого отобранного растения на индивидуальной делянке, в F₃ и F₄ поступают так же, как и в F₂, а в F₅ выделяют гомозиготные по селектируемым признакам формы с максимальным ККГ-эффектом.

РИСУНКИ