Патент на изобретение №2254575

(54) СПОСОБ ТИТРОВАНИЯ АНТИРАБИЧЕСКИХ ВИРУСНЕЙТРАЛИЗУЮЩИХ АНТИТЕЛ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, конкретно к способу титрования вируснейтрализующих антител против бешенства в сыворотке крови вакцинированных животных. Сущность способа состоит в том, что проводят взаимодействие вакцинного вируса бешенства штамма 71 БелНИИЭВ-ВГНКИ с исследуемыми сыворотками, реакционную смесь вирус-сыворотка инкубируют 60 мин при 37°С, вносят суточную интактную культуру клеток почки сайги и помещают в СО₂ инкубатор с последующим определением на 5-7 сутки титра вирус-нейтрализующих антител по предельному разведению сыворотки, при котором наблюдалось 50% подавление цитопатического действия вируса на культуру клеток. Техническим результатом является разработка чувствительного, более технологичного и экономически обоснованного способа титрования антирабических вируснейтрализующих антител. 2 табл.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, а именно к способу титрования вируснейтрализующих антител против бешенства в сыворотке крови вакцинированных животных, основанному на ингибиции цитопатического действия (ЦПД) вируса бешенства в культуре клеток, и может быть использовано в научно-исследовательских институтах и ветеринарных лабораториях.

В настоящее время для титрования антирабических антител in vitro разработаны и применяются различные методы.

Принцип постановки реакции в приведенных источниках практически идентичен и заключается в том, что разведения сывороток смешивают с равным объемом вируса и инкубируют при 37°С в течение 90 минут, после чего реакционную смесь вносят в соответствующую культуру клеток и инкубируют 72 часа при 37°С. Затем культуру клеток фиксируют, обрабатывают антирабическими иммуноглобулинами конъюгированными с флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ-конъюгат) и посредством люминесцентной микроскопии проводят учет реакции.

Предложенные методы предполагают фиксацию клеток формалином или ацетоном, которые представляют собой токсичные препараты, и использование высокоспецифичных антирабических иммуноглобулинов, конъюгированных с флуоресцеинизотиоционатом, что несколько усложняет технологию тестирования сывороток крови животных и повышает себестоимость анализа.

Целью предлагаемого изобретения является разработка чувствительного, более технологичного и экономически обоснованного способа титрования антирабических вируснейтрализующих антител, имеющего корреляцию с результатами титрования антител в тесте ингибиции фокусов флуоресценции.

Поставленная цель достигается тем, что используется вакцинный штамм 71БелНИИЭВ-ВГНКИ (РБ-71), адаптированный к культуре клеток ПС, в которой проводится инкубирование реакционной смеси вирус-сыворотка в течение 60 мин, с последующим определением, на 5-7 сутки, титра вируснейтрализующих антител по ингибиции цитопатического действия вируса в культуре клеток ПС.

В отечественной литературе материалов и результатов подобных исследований нет.

ПРИМЕРЫ КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ

ПРИМЕР 1.

Испытуемые сыворотки, полученные от вакцинированных животных, инактивировали при 56°С в течение 30 мин, затем в 96-луночных панелях для микрокультивирования готовили двукратные разведения на среде Игла (MEM) в объеме 50 мкл. Разведенные сыворотки смешивали с равным объемом культурального вируса бешенства, шт. РБ-71, содержащим 50-100 ККИД₅₀ (рабочее разведение). Приготовленные таким образом реакционные смеси инкубировали в течение 60 мин при 37°С, после чего вносили в односуточную интактную культуру клеток ПС, выращенную в 96-луночных панелях, предварительно удалив из лунок культуральную среду.

Панели помещали в СО₂-инкубатор (при 37°С с содержанием 5% углекислого газа и 95% влажности). Контролями служили лунки с используемой дозой вируса, смесью вируса с заведомо положительной (специфической) и отрицательной (нормальной) сыворотками, а также интакной культурой клеток.

Начиная с 4 суток культуру клеток в панелях просматривали при помощи инвертированного светового микроскопа Olympus, увеличение х40-80. В лунках с контролем вируса и нормальной сывороткой наблюдалось ярко выраженное ЦПД, которое характеризовалось набуханием пораженных клеток ПС, их округлением с появлением зернистости в цитоплазме, последующим разрушением и отделением от стекла, в то же время в лунках со специфической сывороткой ЦПД не проявлялось (нейтрализация вируса), что указывает на наличие в испытуемых сыворотках антирабических вируснейтрализующих антител.

ПРИМЕР 2.

Подготовку испытуемых сывороток с последующим приготовлением смеси вирус-сыворотка проводили аналогично схеме, описанной в примере 1. По истечении срока инкубирования реакционных смесей (60 мин при 37°С) в каждую лунку панелей вносили 100 мкл суспензии культуры клеток ПС в концентрации 300-500 тыс. клеток/см³, после чего планшеты помещали в СO₂-инкубатор (при 37°С с содержанием 5% углекислого газа и 95% влажности). Последующие этапы осуществляли согласно предыдущей методике.

Учет результатов реакции проводили на 5-7 сутки. Титром антирабических антител в испытуемом материале являлось предельное разведение сыворотки, при котором наблюдалось 50%-ное подавление цитопатического действия вируса на культуру клеток, т.е. нейтрализация вируса. При проведении исследований результаты определения антител в обоих примерах были аналогичны.

Результаты исследования сывороток крови тестом ингибиции фокусов флуоресценции и предлагаемой нами реакцией нейтрализации в культуре клеток ПС приведены ниже (табл. 1).

Как видно из данных, приведенных в табл. 1, результаты тестирования сывороток двумя методами были идентичны.

С целью сокращения времени и оптимизации условий постановки реакции нами проведены исследования по влиянию времени инкубирования смеси вирус-сыворотка на результаты реакции (табл. 2).

По данным табл. 2 видно, что оптимальным временем инкубирования смеси вирус-сыворотка является 60 мин (в отличие от традиционных 90 мин).

Таким образом, результаты титрования антирабических антител предложенным нами способом соответствуют результатам теста ингибиции фокусов флуоресценции. Предложенный способ титрования антирабических вируснейтрализующих антител прост в исполнении, высокочувствителен и является технологичным и экономически обоснованным, в связи с отсутствием необходимости использования токсичных фиксаторов и ФИТЦ-конъюгата и может быть использован при оценке иммунного статуса у животных, вакцинированных против бешенства.

Формула изобретения

Способ титрования антирабических вируснейтрализующих антител, включающий взаимодействие вакцинного вируса бешенства с исследуемыми сыворотками, отличающийся тем, что используют штамм 71 БелНИИЭВВГНКИ, реакционную смесь вирус – сыворотка инкубируют 60 мин при 37°С, вносят суточную интактную культуру клеток почки сайги и помещают в СО₂-инкубатор с последующим определением на 5-7 сутки титра вируснейтрализующих антител по предельному разведению сыворотки, при котором наблюдалось 50%-ное подавление цитопатического действия вируса на культуру клеток.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 11.07.2005

Извещение опубликовано: 27.01.2007 БИ: 03/2007