Патент на изобретение №2253115

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЩЕГО БЕЛКА, БЕЛКОВЫХ ФРАКЦИЙ И ЛИПИДНЫХ КОМПОНЕНТОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ

(57) Реферат:

Изобретенрие относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике. Сущность способа состоит в следующем: из сыворотки крови пациента получают два контрольных образца № 1 и № 2, затем в акустические ячейки двух аналогичных подключенных к компьютеру устройств для контроля биологических жидкостей с постоянно поддерживаемой в них температурой от 15 до 40°С, которая в первом устройстве ниже, чем во втором, последовательно помещают дистиллированную воду, сыворотку крови и контрольные образцы № 1 и № 2, пропускают через них ультразвук с частотой, изменяющейся в диапазоне от 2 до 40 МГц, и определяют скорость его прохождения в каждой из сред, относительные изменения скоростей ультразвука в сыворотке крови в первом и втором устройствах при соответствующих температурах и в контрольных образцах № 1 и № 2 относительно дистиллированной воды, а также частотный коэффициент скорости ультразвука и частотный коэффициент поглощения ультразвука в сыворотке крови. На основании полученных данных определяют концентрацию общего белка, белковых фракций и липидных компонентов в сыворотке крови. Способ является точным, информативным, универсальным, т.к. позволяет одновременно определять в сыворотке крови все компоненты, что дает возможность выявить и оценить тяжесть заболевания, глубину метаболических нарушений, позволяет следить за динамикой патологического процесса. 3 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может применяться для определения общего белка, белковых фракций (альбумина, ₁-, ₂-, -, -глобулинов) и липидных компонентов (холестерина общего, холестерина липопротеидов высокой плотности (ЛПВП), триглицеридов и -липопротеидов) сыворотки крови с целью скрининга заболеваний у населения.

Используемые в настоящее время методы определения данных компонентов сыворотки крови обладают рядом существенных недостатков, общими из которых являются: недостаточная точность и длительное время проведения анализа; зависимость результатов от качества используемых реактивов; подверженность белков сыворотки крови разного рода воздействиям; чувствительность существующих методов к температуре.

Кроме того, каждый из известных способов предназначен для определения только одного из компонентов. Отсутствует единый универсальный метод одновременного определения всех указанных компонентов сыворотки крови.

Известен фотометрический биуретовый способ определения общего белка (Медицинские лабораторные технологии. Справочник. Том 2. Под редакцией А.И.Карпищенко. Санкт-Петербург: Интермедика. 1999. Стр. 58-59), включающий смешивание сыворотки крови с биуретовым реактивом, в результате которого атом меди связывает атомы азота белка с образованием цветных соединений. В две пробирки наливают по 5 мл биуретого реактива. В одну из пробирок добавляют, избегая образования пены, 0,1 мл исследуемой сыворотки крови (опытная проба), в другую – 0,1 мл изотонического раствора NaCl (контрольная проба). Содержимое пробирок тщательно перемешивают. Через 30 мин опытную пробу фотометрируют против контрольной при длине волны 540-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с длиной оптического пути 10 мм. Расчет ведут по калибровочному графику, для построения которого из калибровочного раствора альбумина (100 г/л) готовят рабочие растворы с различной концентрацией белка.

Недостатками данного способа являются чувствительность биуретовой реакции к температуре, сложность приготовления биуретового реактива, состоящего из 5 химически чистых веществ, а также выдерживание сыворотки крови после взаимодействия с ним не менее 30 минут и не более 1 часа при определенной температуре. На правильность определения общего белка биуретовым методом влияет качество калибровочного материала и корригирование результатов со значением холостой пробы на реактивы и сыворотку крови.

Для определения липидных компонентов в настоящее время используют ферментативные методы с последующим фотометрированием результата реакции (холестерин общий, триглицериды) и методы осаждения с последующим фотометрированием надосадочной среды (холестерин ЛПВП, -липопротеиды) с целью определения концентрации нужного компонента.

Способ ферментативного определения холестерина общего (Долгов В.В, Титов В.Н., Творогова М.Г., Ройтман А.П., Шевченко Н.Г. Лабораторная диагностика нарушений обмена липидов. Учебное пособие. Москва. 1999 г., стр.23-24) включает несколько этапов:

1. Ферментативный гидролиз эфиров холестерина общего при действии холестеролэстеразы с образованием свободного холестерина и свободных жирных кислот.

2. Окисление холестерина общего кислородом, растворенным в реакционной среде, при действии холестеролоксидазы с образованием холест-4ен-3-ола и перекиси водорода. Образующаяся перекись водорода окисляет хромогены, изменение цвета которых измеряют фотометрически.

К недостаткам способа относятся методические трудности ферментативного определения холестерина общего из-за гетерогенности распределения холестерина общего между липопротеидами и необходимостью полного расщепления эфиров холестерина общего. Полнота гидролиза эфиров холестерина зависит от источника выделения фермента. Микробиальная холестеролэстераза более активно гидролизует эфиры ХСО, образованные насыщенными жирными кислотами, тогда как панкреатическая – полиненасыщенными жирными кислотами. Некоторые компоненты сыворотки крови могут оказывать влияние на результаты определения холестерина общего. Билирубин ингибирует реакцию перексидазы с 4-аминоантипитироном и фенолом. Восстановители сульфгидрильных групп (глютатион, цистеин, дитиотреитол) также оказывают влияние на результаты реакции.

Способ определения холестерина липопротеидов высокой плотности сыворотки крови (Медицинские лабораторные технологии. Справочник. Том 2. Под редакцией А. И. Карпищенко. Санкт-Петербург: Интермедика. 1999. Стр.96-97) включает осаждение и пре -липопротеинов гепарином в присутствии солей марганца и последующее центрифугирование. В растворе остается только холестерин липопротеидов высокой плотности, который определяют любым унифицированным методом.

Однако указанный способ обладает низкой точностью, что обусловлено имеющей место повышенной мутностью надосадочной жидкости, приводящей к дополнительному светорассеянию, которая искажает результат определения нужных компонентов.

В качестве ближайшего аналога принят способ определения белковых фракций сыворотки крови (Медицинские лабораторные технологии. Справочник. Том 2. Под редакцией А.И.Карпищенко. Санкт–Петербург: Интермедика. 1999. Стр.59-61), включающий электрофоретическое разделение исследуемой сыворотки, помещенной в камеру с буферным раствором, через который пропускают электрический ток определенной силы и напряжения. В зависимости от электрического заряда и других физических и химических свойств белковые фракции передвигают к одному из полюсов. В качестве поддерживающей среды при электрофорезе применяют бумагу, пленки ацетата целлюлозы, гели крахмала, агара и комбинированные среды. Оценку результатов производят фотометрически после элюирования фракций или на денситометре.

Недостатком электрофоретического метода разделения белковых фракций сыворотки крови является химическая неоднородность поддерживающей среды, большая продолжительность процессов разделения, окрашивания, отмывания (в случае использования бумаги – 24-36 часов, ацетата целлюлозы – 1-2 часа). Кроме того, для определения процентного содержания белковых фракций сыворотку крови подвергают электрическому воздействию (пропускание достаточного сильного электрического поля через сыворотку), физическому (проникновение через поры бумаги или пленки ацетата целлюлозы), а также химическому (связывание со специальными красителями для идентификации), что ведет к значительному изменению белков.

Задачей изобретения является создание более точного и информативного способа одновременного определения в сыворотке крови общего белка, белковых фракций и липидных компонентов.

Сущность изобретения состоит в том, что способ определения общего белка, белковых фракций и липидных компонентов сыворотки крови характеризуется тем, что из сыворотки крови пациента получают два контрольных образца № 1 и № 2, для чего ее смешивают с 3%-ной трихлоруксусной кислотой при соотношении их объемов соответственно 2:1, при этом для получения контрольного образца № 1 3%-ную трихлоруксусную кислоту перед смешиванием с сывороткой крови доводят разбавлением до концентрации с относительным изменением скорости ультразвука по отношению к дистиллированной воде, равным (-1,38±0,02)·10^-3, а для получения контрольного образца №2 – до концентрации с относительным изменением скорости ультразвука по отношению к дистиллированной воде, равным (+1,38±0,02)·10^-3, перемешивают осадок, добавляют в него раствор натрия двууглекислого NаНСО₃ в объеме, равном объему исходной сыворотки крови, при этом перед добавлением к осадку для получения контрольного образца № 1 его доводят разбавлением до концентрации с относительным изменением скорости ультразвука по отношению к дистиллированной воде, равным (12,0±,05)·10^-3, а для получения контрольного образца № 2 – до концентрации с относительным изменением скорости ультразвука к дистиллированной воде, равным (6,0±0,02)·10^-3, перемешивают каждую из полученных смесей до окончания реакции, отделяют надосадочную жидкость, используя ее в качестве контрольного образца, затем в акустические ячейки двух аналогичных подключенных к компьютеру устройств для ультразвукового контроля биологических жидкостей с постоянно поддерживаемой в них температурой от 15 до 40°С, которая в первом устройстве ниже, чем во втором, последовательно помещают дистиллированную воду, сыворотку крови и контрольные образцы № 1 и № 2, пропускают через них ультразвук с частотой, изменяющейся в диапазоне от 2 до 40 МГц определяют скорость его прохождения в каждой из сред, относительные изменения скоростей ультразвука в сыворотке крови в первом и втором устройствах при соответствующих температурах и в контрольных образцах № 1 и № 2 относительно дистиллированной воды, а также частотный коэффициент скорости ультразвука и частотный коэффициент поглощения ультразвука в сыворотке крови, на основании полученных данных определяют концентрацию общего белка, белковых фракций и липидных компонентов в сыворотке крови.

Концентрацию общего белка в сыворотке крови определяют по формуле:

С_об – концентрация общего белка в г/л;

₁ – относительное изменение скорости ультразвука в сыворотке крови относительно дистиллированной воды, помещенных в первое устройство;

₂ – относительное изменение скорости ультразвука в сыворотке крови относительно дистиллированной воды, помещенных во второе устройство;

А_об – концентрационный коэффициент относительной скорости ультразвука для общего белка.

Белковые фракции сыворотки крови – альбумин, ₁-глобулин, ₂-глобулин, -глобулин, -глобулин определяют путем решения линейной системы уравнений относительно пяти неизвестных, в качестве которых рассматривают указанные компоненты.

Липидные компоненты сыворотки крови – холестерин общий, холестерин липопротеидов высокой плотности, триглицериды общие, -липопротеиды, определяют путем решения линейной системы уравнений относительно четырех неизвестных, в качестве которых рассматривают указанные компоненты.

Использование изобретения позволяет получить следующий технический результат.

Способ обладает высокой точностью и информативностью, поскольку общий белок и липидные компоненты определяют без применения реактивов, т.е. не подвергая компоненты сыворотки крови какому-либо воздействию, а для определения белковых фракций используют два контрольных образца, которые по биохимическим и биофизическим свойствам близки к сыворотке крови и, следовательно, белковые фракции практически не изменяют свои свойства при акустическом способе исследования.

Способ позволяет проводить определение компонентов сыворотки крови более быстро, чем ближайший аналог, в котором пробоподготовка сыворотки крови и проведение электрофореза в расчете на один образец занимает около 25 минут, в то время как акустический способ позволяет выполнить то же исследование за 3 минуты. Кроме того, при использовании спектрофоретического метода применяют ядовитые химические реактивы, оказывающие вредное влияние на организм исследователя.

Акустический способ определения общего белка, белковых фракций и липидных компонентов универсален, т.к. позволяет одновременно определять в сыворотке крови все компоненты, что дает возможность выявить и оценить тяжесть заболевания, глубину метаболических нарушений, позволяет следить за динамикой патологического процесса при установленном диагнозе, эффективностью проводимой терапии и при необходимости своевременной ее коррекции. Часто тип протеинограммы (общий белок, альбумины, ₁-, ₂ -, -, -глобулины) в дополнение к анамнезу и клиническим данным позволяет выделить диагностическое направление, предположить диагноз. Так, например, при нефротической форме гломерулонефрита выявляется значительное снижение альбуминов и повышение ₂-, -глобулинов, умеренное понижение -фракций, при поражении печени – умеренное уменьшение альбуминов, увеличение -глобулинов и резко выраженный рост -глобулинов.

Технический результат достигается за счет того, что в способе для определения общего белка, белковых фракций и липидных компонентов сыворотки крови впервые применили полученные по разработанной авторами методике два контрольных образца № 1 и № 2 из сыворотки крови с использованием особым образом приготовленных растворов трихлоруксусной кислоты и натрия двууглекислого, последовательного помещения в акустические ячейки двух аналогичных подключенных к компьютеру устройств для ультразвукового контроля биологических жидкостей (RU 2039978, кл. G 01 N 29/02, 1995 г.) с постоянно поддерживаемой в них температурой от 15 до 40°С, которая в первом устройстве ниже, чем во втором, дистиллированной воды, сыворотки крови и контрольных образцов № 1 и № 2, пропускания через них ультразвука с частотой, изменяющейся в диапазоне от 2 до 40 МГц, и последующим определением скорости его прохождения в каждой из сред, относительных изменений скоростей ультразвука в сыворотке крови в первом и втором устройствах при соответствующих температурах и контрольных образцах № 1 и № 2 относительно дистиллированной воды, а также частотного коэффициента скорости ультразвука и частотного коэффициента поглощения ультразвука в сыворотке крови. На основании полученных данных определяют концентрацию общего белка, белковых фракций и липидных компонентов в сыворотке крови.

Способ осуществляется следующим образом.

У пациента из локтевой вены натощак забирают 5 мл крови без антикоагулянта и оставляют на 1,5 часа при комнатной температуре для образования сыворотки крови. Затем пробирку с кровью центрифугируют. 0,02-1,0 мл сыворотки крови отбирают в одну чистую сухую пробирку для получения контрольного образца № 1. В другую чистую сухую пробирку отбирают 0,02-1,0 мл сыворотки крови для получения контрольного образца № 2. Контрольные образцы № 1 и № 2 готовят параллельно путем смешивания сыворотки крови с 3%-ной трихлоруксусной кислотой при соотношении их объемов соответственно 2:1, перемешивания осадка, добавления раствора натрия двууглекислого NаНСО₃ в объеме, равном объему исходной сыворотки крови, перемешивания смеси до окончания реакции, отделения надосадочной жидкости центрифугированием, которую используют в качестве контрольного образца.

При этом при получении контрольного образца № 1 3%-ную трихлоруксусную кислоту перед смешиванием с сывороткой крови доводят разбавлением до концентрации с относительным изменением скорости ультразвука по отношению к дистиллированной воде, равным (-1,38±0,02)·10^-3, с помощью устройства для контроля биологических жидкостей, для чего после каждого этапа разбавления трихлоруксусную кислоту помещают в акустическую ячейку устройства и измеряют относительное изменение скорости ультразвука в ней. Раствор NaHCO₃ перед добавлением к осадку доводят разбавлением аналогичным образом до концентрации с относительным изменением скорости ультразвука по отношению к дистиллированной воде, равным (12,0±0,05)·10^-3.

При получении контрольного образца № 2 3%-ную трихлоруксусную кислоту перед смешиванием с сывороткой крови доводят разбавлением до концентрации с относительным изменением скорости ультразвука по отношению к дистиллированной воде, равным (1,38±0,02)·10^-3, а раствор NаНСО₃ перед добавлением к осадку доводят до концентрации с относительным изменением скорости ультразвука по отношению к дистиллированной воде, равным (6,0±0,02)·10^-3.

Затем в акустические ячейки двух аналогичных подключенных к компьютеру устройств для контроля биологических жидкостей, в которых постоянно поддерживают температуру от 15 до 40°С, при условии, что в первом устройстве она ниже, чем во втором, последовательно помещают дистиллированную воду, сыворотку крови и контрольные образцы № 1 и № 2, пропуская через них ультразвук с частотой, изменяющейся в диапазоне от 2 до 40 МГц, и определяют скорость его прохождения в каждой из сред.

Вначале помещают дистиллированную воду в акустические ячейки первого и второго устройства для контроля биологических жидкостей. На оба устройства подают сигнал частотой, изменяющейся на 10 МГц из любой части диапазона от 2 до 40 МГц (например, от 5,0 до 15,0 МГц) с высокочастотного генератора (например, ГЧ-164), управляемого персональным компьютером. В устройствах электрический сигнал преобразуется на пьезоизлучателе в ультразвуковой сигнал той же частоты, который распространяется в дистиллированной воде, находящейся в акустических ячейках устройств. Пьезоприемники преобразуют ультразвуковой сигнал в высокочастотный электрический сигнал, который поступает на высокочастотный переключатель, управляемый компьютером, который через этот переключатель подсоединяет к высокочастотному микровольтметру (например, ВЗ-48) то одно, то другое устройство для контроля биожидкостей. Продетектированный высокочастотный сигнал с выхода высокочастотного микровольтметра поступает на вольтметр постоянного тока (например, В7-53), также управляемый компьютером. В результате обработки данных, получаемых с пьезоприемников устройств для контроля биологических жидкостей, в памяти компьютера фиксируются центральные частоты всех резонансных пиков в выбранном диапазоне частот (например, от 5,0 до 15,0 МГц) для дистиллированной воды.

Затем в акустические ячейки первого и второго устройств помещают сыворотку крови, и аналогично в памяти компьютера фиксируются центральные частоты всех резонансных пиков в том же диапазоне (например, от 5,0 до 15,0 МГц) для сыворотки крови.

Затем в акустические ячейки первого и второго устройств помещают соответственно контрольный образец № 1, и контрольный образец № 2, и для них аналогично в памяти компьютера фиксируются частоты всех резонансных пиков в том же диапазоне (например, от 5,0 до 15,0 МГц) для обоих контрольных образцов.

Затем компьютер вычисляет среднюю разность частотного расстояния между резонансными пиками и номер выбранного резонансного пика по следующей формуле:

где N – число частотных расстояний между резонансными пиками в выбранном частотном диапазоне;

j – номер выбранного резонансного пика;

t_j – резонансная частота j-ого резонансного пика;

f_j+1-резонансная частота j+1-ого резонансного пика.

Затем выбирают значения центральных частот резонансных пиков одного и того же номера для дистиллированной воды, сыворотки крови и контрольных образцов №1 и №2 и вычисляют соответствующие скорости ультразвука по формулам:

где v^(H2O)1,2 – скорость ультразвука в дистиллированной воды в первом и втором устройствах;

f^(H2O)1,2j – центральные частоты резонансных пиков номера j для дистиллированной воды в первом и втором устройствах;

Z_j(H2O)1,2 – продольные волновые числа в первом и втором устройствах с дистиллированной водой;

R – радиус устройства для контроля биологических жидкостей

где V^(S)1,2 – скорость ультразвука в сыворотке крови в первом и втором устройствах;

f^(S)1,2 _j – центральные частоты резонансных пиков номера j для сыворотки крови в первом и втором устройствах;

Z_j(S)1,2 – продольные волновые числа в первом и втором устройствах с сывороткой крови;

R – радиус устройства для контроля биологических жидкостей;

где V^(mS)1,2 – скорость ультразвука в контрольных образцах № 1 и № 2;

f_j ^(mS)1,2 _ центральные частоты резонансных пиков номера j для контрольных образцов № 1 и № 2;

Z_j(mS)1,2 – продольные волновые числа для контрольных образцов № 1 и № 2;

R – радиус устройства для контроля биологических жидкостей.

На основании результатов, полученных по формулам для V^(H2O)1,2, V^(S)1,2, V^(mS)1,2 вычисляют относительные изменения скорости ультразвука в сыворотке крови в первом и втором устройствах при соответствующих температурах, относительные изменения скорости ультразвука в контрольных образцах №1 и №2 относительно дистиллированной воды по формулам:

где V^(H2O)1,2 – скорость ультразвука в дистиллированной воды в первом и втором устройствах;

V^(S)1,2– скорость ультразвука в сыворотке крови в первом и втором устройствах;

V^(mS)1,2– скорость ультразвука в контрольных образцах № 1 и № 2;

₁ – относительное изменение скорости ультразвука в сыворотке крови относительно дистиллированной воды, помещенных в первое устройство;

₂ – относительное изменение скорости ультразвука в сыворотке крови относительно дистиллированной воды, помещенных во второе устройство;

₃ – относительное изменение скорости ультразвука в контрольном образце №1 относительно дистиллированной воды, помещенных в первое устройство;

₄ – относительное изменение скорости ультразвука в контрольном образце №2 относительно дистиллированной воды, помещенных во второе устройство.

Определяют частотный коэффициент поглощения ультразвука и частотный коэффициент скорости ультразвука в сыворотке крови при изменении частоты на 10 МГц в диапазоне частот от 2 до 40 МГц по формулам:

где – частотный коэффициент скорости ультразвука в сыворотке крови для первого устройства;

– относительное изменение скорости ультразвука в сыворотке крови относительно дистиллированной воды, помещенных в первое устройство при частоте f₂ из диапазона от 2 до 40 МГц;

– относительное изменение скорости ультразвука в сыворотке крови относительно дистиллированной воды, помещенных в первое устройство при частоте f₁ из диапазона от 2 до 40 МГц;

– частотный коэффициент поглощения ультразвука в сыворотке крови для второго устройства;

– коэффициент поглощения ультразвука в сыворотке крови во втором устройстве при частоте f₂ из диапазона от 2 до 40 МГц;

– коэффициент поглощения ультразвука в сыворотке крови во втором устройстве при частоте f₁ из диапазона от 2 до 40 МГц.

После этого определяют концентрацию общего белка в сыворотке крови по формуле

где С_об – концентрация общего белка в г/л;

₁– относительное изменение скорости ультразвука в сыворотке крови относительно дистиллированной воды, помещенных в первое устройство;

₂ – относительное изменение скорости ультразвука в сыворотке крови относительно дистиллированной воды, помещенных во второе устройство;

А_об – концентрационный коэффициент относительной скорости ультразвука для общего белка.

Величина концентрационного коэффициента А_об в формуле для определения общего белка находится общепринятым образом для каждого конкретного устройства №1 и №2 после выбора температуры T₁ и Т₂ (T₂>T₁) с использованием калибратора в виде водных растворов альбумина (см. Справочник “Медицинские лабораторные технологии”, том 2, под редакцией Ф.И.Карпищенко, Санкт-Петербург, 1999 г, стр.58-59). Белковые фракции сыворотки крови – альбумин, 1-глобулин, 2-глобулин, -глобулин, -глобулин определяют путем решения линейной системы уравнений относительно пяти неизвестных, в качестве которых рассматривают указанные компоненты:

С=100%-С_ал-С₁-С₂-С

относительно неизвестных:

С_ал – процентная доля альбумина в сыворотке крови;

C₁ – процентная доля ₁-глобулина в сыворотке крови;

С₂ – процентная доля ₂-глобулина в сыворотке крови;

С – процентная доля -глобулина в сыворотке крови;

С – процентная доля -глобулина в сыворотке крови;

где А_ал ^T1, A₁ ^T1, А₂ ^T1, А^T1, A^T1 – концентрационные коэффициенты скорости ультразвука для альбумина, ₁-глобулина, ₂-глобулина, -глобулина, -глобулина соответственно в первом устройстве в сыворотке крови;

В_ал ^T2, B₁ ^T2, B₂ ^T2, В^T2, B^T2 – концентрационные коэффициенты поглощения ультразвука для альбумина, ₁-глобулина, ₂-глобулина, -глобулина, -глобулина соответственно во втором устройстве в сыворотке крови;

(К_ал ^T2)₁, (K₁ ^T2)₁, (К₂ ^T2)_i, (K^T2)₁ – концентрационные коэффициенты скорости ультразвука для альбумина, ₁-глобулина, ₂-глобулина, -глобулина в контрольном образце № 1 во втором устройстве;

(K_ал ^T1)₂, (K₁ ^T1)₂, (K₂ ^T1)₂ – концентрационные коэффициенты скорости ультразвука для альбумина, ₁-глобулина, ₂-глобулина, -глобулина в контрольном образце № 2 в первом устройстве. Система уравнений для определения белковых фракций приобретает классический вид, общеизвестный и описанный во всех справочниках по высшей математике (см. Г.Корн и Т.Корн. Справочник по математике для научных работников и инженеров. Москва: Наука, 1970 г., стр.49), т.к. концентрационные коэффициенты в третьем уравнении K^T2=0, в четвертом уравнении К^T1=К^T1=0. Это оказывается возможным благодаря использованию контрольных образцов № 1 и № 2, способ получения которых описан в формуле изобретения, и позволяет получить сывороточные объекты без -глобулинов (уравнение 3) и без – и -глобулинов (уравнение 4), в пятом уравнении концентрационные коэффициенты при С_ал, C₁, С₂, С равны 1 (единице), при С равен (-1). Величины концентрационных коэффициентов в системе уравнений для определения белковых фракций сыворотки крови – альбумина, 1-глобулина, 2-глобулина, -глобулина и -глобулина определяют общепринятым образом для каждого конкретного устройства № 1 и № 2 после выбора температуры T₁ и Т₂ (Т₂>T₁) с использованием сывороток с известными значениями белковых фракций (см. Справочник “Медицинские лабораторные технологии”, том 2, под редакцией Ф.И.Карпищенко. Санкт-Петербург, 1999 г., стр.59-60), например сывороток крови фирмы Human (Германия): Serodos – сыворотка с паспортными значениями в области нормальных показателей белковых фракций человека и Serodos plus – сыворотка с паспортными значениями в области патологии белковых фракций человека.

Липидные компоненты сыворотки крови – холестерин общий, холестерин липопротеидов высокой плотности, триглицериды общие, -липопротеиды определяют путем решения линейной системы уравнений относительно четырех неизвестных, в качестве которых рассматривают указанные компоненты:

С_Xоб – концентрация холестерина общего в сыворотке крови в ммоль/л;

С_ХЛПВП – концентрация холестерина липопротеидов высокой плотности в сыворотке крови в ммоль/л;

С_ТрГ – концентрация триглицеридов в сыворотке крови в ммоль/л;

С_ЛП – концентрация -липопротеидов в сыворотке крови в г/л;

где ₁ – коэффициент поглощения ультразвука в сыворотке крови в первом устройстве;

₂ – коэффициент поглощения ультразвука в сыворотке крови во втором устройстве;

(А_Xоб)₀₁, (А_ХЛПВП)₀₁, (А_ТрГ)₀₁, (А_ЛП)₀₁ – концентрационные коэффициенты скорости ультразвука в сыворотке крови для холестерина общего, холестерина липопротеидов высокой плотности, триглицеридов, -липопротеидов соответственно в первом устройстве;

(А_Xоб)₀₂, (А_ХЛПВП)₀₂, (А_ТрГ)₀₂, (А_ЛП)₀₂ – концентрационные коэффициенты скорости ультразвука в сыворотке крови для холестерина общего, холестерина липопротеидов высокой плотности, триглицеридов, -липопротеидов соответственно во втором устройстве;

(B_Xоб)₀₁, (В_ХЛПВП)₀₁, (В_ТрГ)₀₁, (В_ЛП)₀₁ – концентрационные коэффициенты поглощения ультразвука в сыворотке крови для холестерина общего, холестерина липопротеидов высокой плотности, триглицеридов, -липопротеидов соответственно в первом устройстве;

(B_Xоб)₀₂, (B_ХЛПВП)₀₂, (B_ТpГ)₀₂, (В_ЛП)₀₂ – концентрационные коэффициенты поглощения ультразвука в сыворотке крови для холестерина общего, холестерина липопротеидов высокой плотности, триглицеридов, -липопротеидов соответственно во втором устройстве.

Величины концентрационных коэффициентов в системе уравнений для определения липидных компонентов сыворотки крови – холестерина общего, холестерина липопротеидов высокой плотности, триглицеридов и -липопротеидов, находят общепринятым образом для каждого конкретного устройства № 1 и № 2 после выбора температуры T₁ и T₂ (T₂>T₁) с использованием калибраторов с известными значениями указанных липидных компонентов (см. Справочник “Медицинские лабораторные технологии”, том 2, под редакцией Ф.И.Карпищенко. Санкт-Петербург, 1999 г, стр.92-97).

Пример 1. Больная Н, 58 лет, диагноз гипертония II степени. Из локтевой вены натощак забирают 5 мл крови без антикоагулянта и оставляют на 1,5 часа при комнатной температуре для образования сыворотки крови. Затем пробирку с кровью центрифугируют 0,2 мл сыворотки крови отбирают в одну чистую сухую пробирку для получения контрольного образца № 1. В другую чистую сухую пробирку отбирают 0,2 мл сыворотки крови и получают контрольный образец № 2. Контрольные образцы № 1 и № 2 готовят путем смешивания сыворотки крови с 3%-ной трихлоруксусной кислотой, перемешивания осадка, добавления раствора натрия двууглекислого NaHCO₃ в объеме, равном объему исходной сыворотки крови и перемешивания смеси до окончания реакции и центрифугирования, используя полученную надосадочную жидкость в качестве контрольного образца № 1 и № 2. При получении контрольного образца № 1 3%-ную трихлоруксусную кислоту перед смешиванием с сывороткой крови доводят разбавлением до концентрации с относительным изменением скорости ультразвука по отношению к дистиллированной воде, равным (-1,38±0,02)·10^-3, а раствор NаНСО₃ перед добавлением к осадку доводят до концентрации с относительным изменением скорости ультразвука по отношению к дистиллированной воде, равным (12,0±0,05)·10^-3.

При получении контрольного образца № 2 3%-ную трихлоруксусную кислоту перед смешиванием с сывороткой крови доводят разбавлением до концентрации с относительным изменением скорости ультразвука по отношению к дистиллированной воде, равным (1,38±0,02)·10^-3, а раствор NаНСО₃ перед добавлением к осадку доводят до концентрации с относительным изменением скорости ультразвука по отношению к дистиллированной воде, равным (6,0±0,02)·10^-3. Затем помещают дистиллированную воду в акустические ячейки двух аналогичных устройств для контроля биологических жидкостей, подключенных к компьютеру, в них постоянно поддерживают температуру, которая в первом устройстве ниже, чем во втором: в первом устройстве 15°С, а во втором 40°С. На оба устройства подают сигнал частотой, изменяющейся на 10 МГц из любой части диапазона от 2 до 40 МГц (например, от 5,0 до 15,0 МГц), с высокочастотного генератора (например, ГЧ-164), управляемого персональным компьютером. В устройствах электрический сигнал преобразуется на пьезоизлучателе в ультразвуковой сигнал той же частоты, который распространяется в дистиллированной воде, находящейся в акустических ячейках устройств. Пьезоприемники преобразуют ультразвуковой сигнал в высокочастотный электрический сигнал, который поступает на высокочастотный переключатель, управляемый компьютером, который через этот переключатель, подсоединяет к высокочастотному микровольтметру (например, В3-48) то одно, то другое устройство для контроля биожидкостей. Продетектированный высокочастотный сигнал с выхода высокочастотного микровольтметра поступает на вольтметр постоянного тока (например, В7-53), также управляемый компьютером. В результате обработки данных, получаемых с пьезоприемников устройств для контроля биологических жидкостей, в памяти компьютера фиксируются центральные частоты всех резонансных пиков в выбранном диапазоне частот (например, от 5,0 до 15,0 МГц) для дистиллированной воды. Затем в оба устройства помещают сыворотку крови, и аналогично в памяти компьютера фиксируются центральные частоты всех резонансных пиков в том же диапазоне (например, от 5,0 до 15,0 МГц) для сыворотки крови. Затем в первое устройство помещают контрольный образец №1, а во второе устройство помещают контрольный образец №2, и для них аналогично в памяти компьютера фиксируются частоты всех резонансных пиков в том же диапазоне (например, от 5,0 до 15,0 МГц) для обоих контрольных образцов. Затем компьютер вычисляет среднюю разность частотного расстояния между резонансными пиками и номер, выбранного резонансного пика по следующей формуле

где N – число частотных расстояний между резонансными пиками в выбранном частотном диапазоне;

j – номер выбранного резонансного пика;

f_j – резонансная частота j-ого резонансного пика;

f_j+1 – резонансная частота j+1-ого резонансного пика.

Затем выбирают значения центральных частот резонансных пиков одного и того же номера для дистиллированной воды, сыворотки крови и контрольных образцов №1 и №2 и вычисляют соответствующие скорости ультразвука по формулам:

где V^(H2O)1,2 – скорость ультразвука в дистиллированной воды в первом и втором устройствах;

f^(H2O)1,2 _j – центральные частоты резонансных пиков номера j для дистиллированной воды в первом и втором устройствах;

Z_j(H2O)1,2 – продольные волновые числа в первом и втором устройствах с дистиллированной водой;

R – радиус устройства для контроля биологических жидкостей;

где V^(S)1,2 – скорость ультразвука в сыворотке крови в первом и втором устройствах;

f^(S)1,2 _j – центральные частоты резонансных пиков номера j для сыворотки крови в первом и втором устройствах;

Z_j(S)1,2 – продольные волновые числа в первом и втором устройствах с сывороткой крови;

R – радиус устройства для контроля биологических жидкостей;

где V^(mS)1,2 – скорость ультразвука в контрольных образцах № 1 и № 2;

f^(mS)1,2 _j – центральные частоты резонансных пиков номера j для контрольных образцов № 1 и № 2;

Z_j(mS)1,2 – продольные волновые числа для контрольных образцов № 1 и № 2;

R – радиус устройства для контроля биологических жидкостей.

На основании результатов, полученных по формулам для V^(H2O)1,2, V^(S)1,2, V^(mS)1,2 вычисляют относительные изменения скорости ультразвука в сыворотке крови в первом и втором устройствах, относительные изменения скорости ультразвука в контрольных образцах № 1 и № 2 относительно дистиллированной воды по формулам

где V^(H2O)1,2 – скорость ультразвука в дистиллированной воды в первом и втором устройствах;

V^(S)1,2 – скорость ультразвука в сыворотке крови в первом и втором устройствах;

V^(mS)1,2 – скорость ультразвука в контрольных образцах №1 и №2;

₁ – относительное изменение скорости ультразвука в сыворотке крови относительно дистиллированной воды, помещенных в первое устройство;

₂ – относительное изменение скорости ультразвука в сыворотке крови относительно дистиллированной воды, помещенных во второе устройство;

₃ – относительное изменение скорости ультразвука в контрольном образце №1 относительно дистиллированной воды, помещенных в первое устройство;

₄ – относительное изменение скорости ультразвука в контрольном образце №2 относительно дистиллированной воды, помещенных во второе устройство.

Определяют частотный коэффициент поглощения ультразвука и частотный коэффициент скорости ультразвука в сыворотке крови при изменении частоты на 10 МГц в диапозоне частот от 2 до 40 МГц по формулам

где – частотный коэффициент скорости ультразвука в сыворотке крови для первого устройства;

– относительное изменение скорости ультразвука в сыворотке крови относительно дистиллированной воды, помещенных в первое устройство при частоте f₂ из диапазона от 2 до 40 МГц;

– относительное изменение скорости ультразвука в сыворотке крови относительно дистиллированной воды, помещенных в первое устройство при частоте f₁ из диапазона от 2 до 40 МГц;

– частотный коэффициент поглощения ультразвука в сыворотке крови для второго устройства;

– коэффициент поглощения ультразвука в сыворотке крови во втором устройстве при частоте f₂ из диапазона от 2 до 40 МГц;

– коэффициент поглощения ультразвука в сыворотке крови во втором устройстве при частоте f₁ из диапазона от 2 до 40 МГц.

После этого определяют концентрацию общего белка в сыворотке крови по формуле

где С_об – концентрация общего белка в г/л;

₁ – относительное изменение скорости ультразвука в сыворотке крови относительно дистиллированной воды, помещенных в первое устройство;

₂ – относительное изменение скорости ультразвука в сыворотке крови относительно дистиллированной воды, помещенных во второе устройство;

А_об – концентрационный коэффициент относительной скорости ультразвука для общего белка.

Белковые фракции сыворотки крови – альбумин, 1-глобулин, 2-глобулин, -глобулин, -глобулин, определяют путем решения линейной системы уравнений:

С=100%-С_ал-С₁-С₂-С

относительно пяти неизвестных:

С_ал – процентная доля альбумина в сыворотке крови;

C₁ – процентная доля ₁-глобулина в сыворотке крови;

С₂ – процентная доля ₁-глобулина в сыворотке крови;

С – процентная доля -глобулина в сыворотке крови;

С – процентная доля -глобулина в сыворотке крови;

где А_ал ^T1, A₁ ^T1, А₂ ^T1, А^T1, А^T1 – концентрационные коэффициенты скорости ультразвука для альбумина, ₁-глобулина, ₂-глобулина, -глобулина, -глобулина соответственно в первом устройстве в сыворотке крови;

В_ал ^T2, В₁ ^T2, В₂ ^T2, В^T2, В^T2 – концентрационные коэффициенты поглощения ультразвука для альбумина, ₁-глобулина, ₂-глобулина, -глобулина, -глобулина соответственно во втором устройстве в сыворотке крови;

(К_ал ^T2)₁, (К₁ ^T2)₁, (K₂ ^T2)₁, (К^T2)₁ – концентрационные коэффициенты скорости ультразвука для альбумина, ₁-глобулина, ₂-глобулина, -глобулина в контрольном образце № 1 во втором устройстве;

(К_ал ^T1)₂, (K₁ ^T1)₂, (К₂ ^T1)₂ – концентрационные коэффициенты скорости ультразвука для альбумина, ₁-глобулина, ₂-глобулина, -глобулина в контрольном образце № 2 в первом устройстве.

Липидные компоненты сыворотки крови определяют путем решения системы уравнений относительно 4 неизвестных:

С_Xоб – концентрация холестерина общего в сыворотке крови в ммоль/л;

С_ХЛПВП – концентрация холестерина липопротеидов высокой плотности в сыворотке крови в ммоль/л;

С_ТрГ – концентрация триглицеридов в сыворотке крови в ммоль/л;

С_ЛП – концентрация – липопротеидов в сыворотке крови в г/л;

где ₁ – коэффициент поглощения ультразвука в сыворотке крови в первом устройстве;

₂ – коэффициент поглощения ультразвука в сыворотке крови во втором устройстве;

(А_Xоб)₀₁, (А_ХЛПВП)₀₁, (А_ТрГ)₀₁, (А_ЛП)₀₁ – концентрационные коэффициенты скорости ультразвука в сыворотке крови для холестерина общего, холестерина липопротеидов высокой плотности, триглицеридов, -липопротеидов соответственно в первом устройстве;

(А_Xоб)₀₂, (А_ХЛПВП)₀₂, (А_ТрГ)₀₂, (А_ЛП)₀₂ – концентрационные коэффициенты скорости ультразвука в сыворотке крови для холестерина общего, холестерина липопротеидов высокой плотности, триглицеридов, -липопротеидов соответственно во втором устройстве;

(В_Xоб)₀₁, (В_ХЛПВП)₀₁, (В_ТрГ)₀₁, (В_ЛП)₀₁ – концентрационные коэффициенты поглощения ультразвука в сыворотке крови для холестерина общего, холестерина липопротеидов высокой плотности, триглицеридов, -липопротеидов соответственно в первом устройстве;

(В_Xоб)₀₂, (В_ХЛПВП)₀₂, (В_ТрГ)₀₂, (В_ЛП)₀₂ – концентрационные коэффициенты поглощения ультразвука в сыворотке крови для холестерина общего, холестерина липопротеидов высокой плотности, триглицеридов, -липопротеидов соответственно во втором устройстве.

Результаты измерений передают в компьютер. За 3 минуты получают следующие значения концентрации компонентов сыворотки крови:

общий белок – 78,3 г/л

альбумин – 57,6%

₁-глобулин – 3,2%

₂-глобулин – 7,9%

-глобулин – 14,7%

-глобулин – 16,6%

холестерин общий – 7,3 ммоль/л

-холестерин – 0,8 ммоль/л

триглицериды – 2,9 ммоль/л

-липопротеиды – 9,6 г/л

что соответствует диагнозу больной Н.

Пример 2. Больной А., 47 лет, диагноз сахарный диабет. Из локтевой вены, натощак взята кровь, после 1,5 часового отстаивания и центрифугирования получена сыворотка крови. Приготовлены два контрольных образца. Для получения первого образца смешивают 0,2 мл сыворотки крови с 0,11 мл трихлоруксусной кислоты со значением относительной скорости – 1,38·10^-3‰, затем перемешивают и добавляют 0,2 мл раствора NаНСО₃ со значением относительной скорости ультразвука 12,0·10^-3‰ перемешивают, затем центрифугируют при 5000 об/мин в течение 2 минут, аналогично готовят второй контрольный образец, но трихлоруксусную кислоту берут с относительной скоростью 1,38·10^-3‰, а NаНСО₃ – 6,0·10^-3‰.

Затем в акустические ячейки двух аналогичных подключенных к компьютеру устройств для контроля биологических жидкостей с постоянно поддерживаемой в них температурой от 15 до 40°С, которая в первом устройстве ниже, чем во втором, последовательно помещают дистиллированную воду, сыворотку крови и контрольные образцы № 1 и № 2, пропускают через них ультразвук с частотой, изменяющейся в диапазоне от 2 до 40 МГц и определяют скорость его прохождения в каждой из сред, относительные изменения скоростей ультразвука в сыворотке крови в первом и втором устройствах при соответствующих температурах и в контрольных образцах №1 и №2 относительно дистиллированной воды, а также частотный коэффициент скорости ультразвука и частотный коэффициент поглощения ультразвука в сыворотке крови, на основании полученных данных определяют концентрацию общего белка, белковых фракций и липидных компонентов в сыворотке крови.

Концентрацию общего белка в сыворотке крови определяют по формуле

где С_об – концентрация общего белка в г/л;

₁ – относительное изменение скорости ультразвука в сыворотке крови относительно дистиллированной воды, помещенных в первое устройство,

₂ – относительное изменение скорости ультразвука в сыворотке крови относительно дистиллированной воды, помещенных во второе устройство,

А_об – концентрационный коэффициент относительной скорости ультразвука для общего белка.

Белковые фракции сыворотки крови – альбумин, ₁-глобулин, ₂-глобулин, -глобулин, -глобулин определяют путем решения линейной системы уравнений относительно пяти неизвестных, в качестве которых рассматривают указанные компоненты.

Липидные компоненты сыворотки крови – холестерин общий, холестерин липопротеидов высокой плотности, триглицериды общие, -липопротеиды определяют путем решения линейной системы уравнений относительно четырех неизвестных, в качестве которых рассматривают указанные компоненты. В результате получены следующие значения компонентов сыворотки крови:

общий белок – 60 г/л

альбумин – 47,0%

₁-глобулин – 5,6%

₂-глобулин – 10,3%

-глобулин – 12,8%

-глобулин – 24,3%

холестерин общий – 6,8 ммоль/л

-холестерин – 0,7 ммоль/л

триглицериды – 3,3 ммоль/л

-липопротеиды – 7,2 г/л,

что соответствует нарушению липидного и белкового обмена, имеющего место при сахарном диабете.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет в короткие сроки (в течение 3 минут) определить все основные параметры белково-липидного спектра сыворотки крови, в то время как при использовании существующих методов на этот технический процесс затрачивается от 2 до 5 часов.

Формула изобретения

Способ определения общего белка, белковых фракций и липидных компонентов сыворотки крови, характеризующийся тем, что из сыворотки крови пациента получают два контрольных образца №1 и №2, для чего ее смешивают с 3%-ной трихлоруксусной кислотой при соотношении их объемов соответственно 2:1, при этом для получения контрольного образца №1 3%-ную трихлоруксусную кислоту перед смешиванием с сывороткой крови доводят разбавлением до концентрации с относительным изменением скорости ультразвука по отношению к дистиллированной воде, равным (-1,38±0,02)·10^-3, а для получения контрольного образца №2 – до концентрации с относительным изменением скорости ультразвука по отношению к дистиллированной воде, равным (+1,38±0,02)·10^-3, перемешивают осадок, добавляют в него раствор натрия двууглекислого NaHCOs в объеме, равном объему исходной сыворотки крови, при этом перед добавлением к осадку для получения контрольного образца №1 его доводят до концентрации с относительным изменением скорости ультразвука по отношению к дистиллированной воде, равным (12,0±0,05)·10^-3, а для получения контрольного образца №2 – до концентрации с относительным изменением скорости ультразвука к дистиллированной воде, равным (6,0±0,02)·10^-3, перемешивают каждую смесь до окончания реакции, отделяют надосадочную жидкость, используя ее в качестве контрольного образца, затем в акустические ячейки двух аналогичных подключенных к компьютеру устройств для контроля биологических жидкостей с постоянно поддерживаемой в них температурой от 15 до 40°С, которая в первом устройстве ниже, чем во втором, последовательно помещают дистиллированную воду, сыворотку крови и контрольные образцы №1 и №2, пропускают через них ультразвук с частотой, изменяющейся в диапазоне от 2 до 40 МГц, и определяют скорость его прохождения в каждой из сред, относительные изменения скоростей ультразвука в сыворотке крови в первом и втором устройствах при соответствующих температурах и в контрольных образцах №1 и №2 относительно дистиллированной воды, а также частотный коэффициент скорости ультразвука и частотный коэффициент поглощения ультразвука в сыворотке крови, на основании полученных данных определяют концентрацию общего белка, белковых фракций и липидных компонентов в сыворотке крови.

2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что концентрацию общего белка в сыворотке крови определяют по формуле

где С_об – концентрация общего белка в г/л;

₁ – относительное изменение скорости ультразвука в сыворотке крови относительно дистиллированной воды, помещенных в первое устройство;

₂ – относительное изменение скорости ультразвука в сыворотке крови относительно дистиллированной воды, помещенных во второе устройство;

А_об – концентрационный коэффициент относительной скорости ультразвука для общего белка.

3. Способ по п.1, характеризующийся тем, что белковые фракции сыворотки крови – альбумин, ₁-глобулин, ₂– глобулин, – глобулин, – глобулин определяют путем решения линейной системы уравнений относительно пяти неизвестных, в качестве которых используют указанные компоненты.

4. Способ по п.1, характеризующийся тем, что липидные компоненты сыворотки крови — холестерин общий, холестерин липопротеидов высокой плотности, триглицериды общие, -липопротеиды – определяют путем решения линейной системы уравнений относительно четырех неизвестных, в качестве которых используют указанные компоненты.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 23.05.2007

Извещение опубликовано: 10.08.2008 БИ: 22/2008

NF4A Восстановление действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

Дата, с которой действие патента восстановлено: 27.04.2010

Извещение опубликовано: 27.04.2010 БИ: 12/2010