Патент на изобретение №2252957
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ AJUGA REPTANS L
(57) Реферат:
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии выращивания растительных тканей, и может быть использована для получения биологически активных веществ, в частности экдистероидов. Питательная среда, позволяющая выращивать клеточную культуру Ajuga reptans L. на агаризованной модифицированной питательной среде, содержит макро- и микросоли по Мурасиге-Скугу, сахарозу – 30 г/л, инозитол – 100 мг/л. Витамины по Стаба содержит, мг/л: фолиевая кислота – 0,5; рибофлавин – 0,5; биотин – 1, Са-пантотенат – 1, пиридоксин – 1, тиамина хлорид – 1, никотинамид – 2, кобаламин – 0,0015 и поливинилпиролидон – 2 г/л, с добавлением
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии выращивания растительных тканей, и может быть использовано для получения биологически активных веществ, в частности экдистероидов. Технический результат настоящего изобретения состоит в определении состава питательной среды для получения клеточной культуры Ajuga reptans L. с высоким содержанием экдистероидов. Технический результат достигается тем, что клеточную культуру Ajuga reptans L. выращивают на агаризованной питательной среде, которая в отличие от прототипа содержит дополнительно Пример 1. Контроль (по прототипу). Для получения клеточной культуры Ajuga reptans L. готовили питательную среду, используя химически чистые реактивы. Готовили агаризованную питательную среду следующего состава: макро- и микросоли по Мурасиге-Скугу, сахароза – 30 г/л, инозитол – 100 мг/л и витамины по Стаба, мг/л: фолиевая кислота – 0,5; рибофлавин – 0,5; биотин -1; Са-пантотенат – 1; пиридоксин – 1; тиамина хлорид – 1; никотинамид – 2; кобаламин – 0,0015 и поливинилпиролидон – 2 г/л. Среду стерилизовали в автоклаве 10 мин при 1 атм. Чашки Петри стерилизовали в сухожаровом шкафу при 180° С, завернутые в бумагу Крафт. В стерильном боксе в чашки Петри разливали по 40 мл питательной среды. Первичную клеточную культуру Ajuga reptans L. пассировали на агаризованную среду. Чашки Петри термостатировали при 26±1°С в условиях темноты. Спустя 4 недели определяли интенсивность роста и содержание экдистероидов в клеточной культуре. Интенсивность роста определяли по изменению сырой массы клеток в цикле выращивания. Повторность вариантов для клеточных культур 5-ти кратная. Экдистероиды определяли в биомассе клеточных культур, которую высушивали при 60° С в течение 24 часов. 50-80 мг высушенной измельченной пробы экстрагировали метанолом в течение 16-18 ч. После центрифугирования аликвоту 1 мл разбавляли дистиллированной водой (1:4) и пропускали через концентрирующий патрон Диапак С 16 (БиоХимМак, Россия). Сорбированные экдистероиды элюировали 3 мл 60%-ного метанола и анализировали ВЭЖХ. Анализ экдистероидов из клеточных культур проводили на хроматографической системе Varian, Pro Star (США), колонка Diasorb C16/T (150× 4мм) (БиоХимМак, Россия), размер частиц 7 мкм; состав элюента: ацетонитрил-вода (100:20, по объему); скорость элюции – 1.5 мл/мин. Детектирование проводили при Содержание в клеточной культуре Ajuga reptans L. 20-гидроксиэкдизона составило 0,293±0,010 мг/г сухой массы, 29-норциастерона + 29-норсенгостерона – 0,031±0,001 мг/г, аюгалактона – 0,096±0,010 мг/г, суммы экдистероидов – 0,420 мг/г. Пример 2-4. Получение клеточной культуры проводят аналогично примеру 1, различием является добавление в среду
При концентрации в среде Пример 5. Получение клеточной культуры проводят аналогично примеру 1, различием является добавление в среду дополнительно МnSO4· 5Н2О 606,5 мг/л. Результаты представлены в таблице 2.
При концентрации в среде MnSO4· 5H2O 630,6 мг/л увеличение концентрации 20-гидроксиэкдизона составляет 309%, концентрации 29-норциастерона + 29-норсенгостерона – 1294%, концентрации аюгалактона – 638%, суммы экдистероидов – 456%. Таким образом, применение предлагаемого состава питательной среды позволяет увеличить содержание экдистероидов в клеточной культуре Ajuga reptans L.
Формула изобретения
Питательная среда для выращивания клеточной культуры Ajuga reptans L., характеризующаяся тем, что она содержит компоненты в следующем количественном соотношении, мг/л: Агар-агар 8000 KNO3 1900 NH4NO3 1650 СаСl2 332 MgSO4· 7Н2О 370 КН2РО4 170 FeSO4· 7Н2О 27,85 Nа2 ЭДТА 37,25 Н3ВО3 6,2 МnSO4· 5Н2O 24,1 ZnSO4· 7Н2О 8,6 Nа2МоО4 0,25 КI 0,83 CuSO4· 5Н2О 0,025 СоСl2· 6Н2О 0,025 сахароза 30000 инозитол 100 фолиевая кислота 0,5 рибофлавин 0,5 биотин 1 Са-пантотенат 1 пиридоксин 1 тиамина хлорид 1 никотинамид 2 кобаламин 0,0015 поливинилпиролидон 2000
MnSO4· 5Н2О 606,5 вода до 1 л
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
-ситостерина от 5 мг/л до 50 мг/л или MnSO4· 5Н2О 606,5 мг/л. Изобретение позволяет увеличить содержание экдистероидов в клеточной культуре Ajuga reptans L. 2 табл.
=242 нм. В качестве стандартов веществ использовали эталонные образцы экдистероидов, полученные в лаборатории биохимии и биотехнологии растений (Институт биологии Коми НЦ УрО РАН). Количество экдистероидов рассчитывали методом абсолютной калибровки.