Патент на изобретение №2153172

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗА

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, к способам диагностики инфекционных заболеваний, а именно псевдотуберкулеза. Сущность способа: диагностическим титром является разведение 1:400 и 1:800, в качестве антигена используется белок порин из внешней мембраны Y.pseudotuberculosis, который является видоспецифическим, а в качестве реагента для предотвращения неспецифического связывания применяется 0,1%-ный раствор желатина медицинского. Способ улучшает диагностику псевдотуберкулеза, поскольку позволяет определять в сыворотке крови больного специфические антитела ко всем серовариантам Y.pseudotuberculosis как в ранние, так и в более поздние сроки болезни (на 1-й неделе заболевания специфические антитела определяются в 59,7%, на 2-й неделе – в 99,2%, на 3-4 неделях – в 98,9% случаев). Данная тест-система является достаточно чувствительным, эффективным и специфичным методом диагностики данного заболевания. 3 ил.

Изобретение относится к медицине, а именно к способам диагностики инфекционных заболеваний, а именно псевдотуберкулеза.

Проблема изучения иерсиниозов, в частности псевдотуберкулеза, остается актуальной и в настоящее время. Широкое распространение, многообразие клинических проявлений, отсутствие патогномоничных симптомов, редкость моносиндромных вариантов определяют трудности распознавания данного заболевания и значительную частоту диагностических ошибок. Доказана роль иерсиний в формировании хронических заболеваний желудочно-кишечного тракта, в развитии коллагенозов и др. [1,2,3]. Диагностика псевдотуберкулеза затруднена и за счет современных эпидемиологических особенностей: в последние годы заболевание протекает в виде спорадических случаев, а не носит характер массовых эпидемических вспышек, регистрировавшихся в Сибири и на Дальнем Востоке в 70-80-х годах нашего столетия [4 – 10]. Только комплексная клинико- лабораторная диагностика с использованием специфических методов позволяет установить истинную природу заболевания [11].

Лабораторная диагностика псевдотуберкулеза осуществляется с помощью бактериологического и серологических методов.

Бактериологическая диагностика трудоемка, занимает много времени (до 28 суток) и недостаточно эффективна (до 12-20% положительных результатов) [12,13,14] . Серологических методов диагностики псевдотуберкулеза описано достаточно много. Условно их можно разделить на две группы: 1) методы выявления непосредственно бактериального антигена в различных биологических жидкостях (кровь, слюна, моча, копрофильтрат); 2) методы определения в сыворотке крови антител к антигенам возбудителя.

К первой группе серологических методов диагностики можно отнести следующие: реакцию торможения непрямой гемагглютинации (РТГА), реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА) с иммуноглобулиновыми эритроцитарными диагностикумами, реакцию коагглютинации (РКоА), иммуноферментный анализ (ИФА), метод иммунофлюоресценции (МИФ). Авторы отмечают высокую специфичность и результативность использования данных методов в ранние сроки болезни (от 40 до 85% положительных результатов на 1-й неделе заболевания), достоверно чаще антиген определяется в копрофильтрате, особенно у больных с выраженным диарейным синдромом. Однако на 2-й неделе болезни этот показатель снижается почти в два раза, а к 3-й неделе составляет 0-9% [12,15,16,17,18]. Следовательно, использование этих методов малоэффективно при обследовании пациентов начиная с 2-й недели болезни, в течение которой процент обращений в лечебные учреждения остается достаточно высоким.

Применение для диагностики псевдотуберкулеза таких высокоинформативных и точных методов, как тест-системы с использованием моноклональных антител, иммуноблотинга, полимеразно-цепной реакции в современных условиях не представляется возможным из-за высокой стоимости приборов и реактивов [19,20,21].

Из серологических методов другой группы (определение антител в сыворотке крови) ранее других стала использоваться реакция агглютинации (РА). РА показала достаточно высокую эффективность (подтверждение диагноза в 75-95% случаев), специфичность и простоту постановки. К недостаткам данного метода можно отнести ретроспективность диагностики, так как антитела в диагностических титрах выявляются зачастую лишь на 3-4-й неделе заболевания. Кроме того, в качестве антигена в РА используются живые культуры псевдотуберкулезного микроба, а поскольку реакция типоспецифична, то необходимо иметь все серотипы псевдотуберкулезного микроба [12,22]. Отсутствие коммерческих антигенов и необходимость постоянного контроля морфологических и культуральных свойств иерсиний перед каждой постановкой РА для исключения диссоциирующих культур не дают возможности широко использовать данный метод в практических лабораториях.

В настоящее время широкое применение нашла РНГА с сухим антигенным псевдотуберкулезным эритроцитарным диагностикумом, описанная А. М. Королюком [14,23,24] . РНГА имеет преимущества перед РА в чувствительности, позволяя выявлять специфические антитела в более ранние сроки, но уступает ей в определении серологических сдвигов (с помощью PA 4-кратные нарастания титров антител у больных выявляются в 60-80% случаев, а в РНГА – только в 40-50%) [12,23,24]. Это позволяет считать РНГА менее диагностически ценной.

Описана возможность использования для диагностики псевдотуберкулеза реакции бактериального лизиса. Этот метод высокоспецифичен, по чувствительности превосходит РА и РНГА в 20-30 раз, дает возможность получить результаты через 3-5 ч [25]. Но ввиду того, что данная реакция типоспецифична, при титрировании сывороток больных ее необходимо ставить с несколькими серовариантами возбудителя псевдотуберкулеза, что приводит к перерасходу материалов, неэкономному использованию рабочего времени, требуется большой объем сыворотки крови.

В 80-х годах В.Н. Багрянцев, А.М. Королюк, В.Б.Сбойчаков и др. [26,27,28,29] проводили исследования возможности определения в сыворотках крови больных псевдотуберкулезом специфических антител к Y. pseudotuberculosis с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Метод включает следующие этапы [29]:
1) посадку антигена на твердый носитель (полистироловый планшет), в качестве диагностического используют антиген, полученный на основе липополисахарида 1В серовара Y. pseudotuberculosis;
2) отмывку планшета;
3) нанесение исследуемой сыворотки, рабочее разведение 1:256;
4) отмывку планшета;
5) нанесение конъюгата;
6) отмывку планшета;
7) нанесение субстратной смеси;
8) регистрацию результатов реакции.

Авторы показали, что титры антител, выявляемых ИФА, в 10 раз превышают титры, определяемые с помощью РНГА. Следовательно, данный метод более эффективен при определении серологических сдвигов, в том числе и в ранние сроки заболевания. Однако в данной реакции используется диагностический антиген, полученный на основе липополисахарида 1 В серовара Y. pseudotuberculosis, который позволяет диагностировать заболевание, вызванное только I серовариантом псевдотуберкулезного микроба. Это ограничивает возможности указанных способов диагностики, так как заболевание могут вызвать возбудители не только I, но и II, III, IV, V и других сероваров. Кроме того, за 15 лет так и не налажено производство диагностикумов для предложенного метода.

Задача изобретения – совершенствование диагностики псевдотуберкулеза за счет определения всех серовариантов Y. pseudotuberculosis и удешевление стоимости ИФА.

Поставленная цель достигается:
1) использованием в тест-системе в качестве антигена видоспецифического белка-порина из внешней мембраны Y. pseudotuberculosis. Порин выделяли по методу Rosenbusch [30] в модификации, описанной в патенте SU N 1415496, А 61 К 39/02, 1987 г. “Способ получения антигена из внешней мембраны бактериальных клеток”;
2) использованием в качестве вещества, предотвращающего неспецифическое связывание, 0,1%-ного раствора желатина медицинского, вместо традиционно используемых более дорогостоящих альбумина или нормальной сыворотки крови [31,32].

Белки-порины наружной мембраны относятся к высокоиммуногенным компонентам наружной мембраны микробной клетки и являются своеобразными иммунологическими маркерами, поскольку оказываются, как правило, характерными для данного вида или рода микроорганизма. Антитела к поринам обнаруживаются в сыворотке крови, как правило, на протяжении всего периода заболевания.

Способ осуществляется следующим образом: диагностику проводят по методике выявления специфических антител в сыворотке крови больного, используя твердофазный иммуноферментный анализ (непрямой, неконкурентный анализ антител). Анализ состоит из следующих этапов:
1) посадка антигена на твердый носитель (полистироловый планшет) (концентрация антигена 100 мкг/мл в карбонат-бикарбонатном буфере pH 9,0);
2) отмывка планшета от несвязавшихся компонентов (3-5 раз по 5 мин, фосфатно-солевой буфер pH 7,4 + 0,05% твин-20 или твин-80 – буфер “А”);
3) инактивация планшета (для предотвращения неспецифического связывания антигена с мечеными антителами, 0,1% медицинский желатин в буфере “А” – буфер “Б”);
4) нанесение исследуемой сыворотки (серию разведений, 1:400, 1:800, готовят на буфере “А”);
5) отмывка планшета (см. выше);
6) нанесение конъюгата (вторые антитела, меченные ферментом, рабочее разведение готовят в буфере “Б”);
7) отмывка планшета (см. выше);
8) нанесение субстрат-индикаторного раствора (0,04% О- фенилендиамин + 5 мкл 33% H₂O₂ в 10 мл фосфатно-цитратного буфера pH 5,0);
9) регистрация результатов реакции.

В процессе работы было установлено, что некоторые партии конъюгатов, выпускаемых различными предприятиями, имеют способность к неспецифическому связыванию с белковым антигеном. Инактивация желатином эффективно предотвращает неспецифическое взаимодействие меченых антител с антигеном, но не оказывает влияния на связывание антигена со специфическими антителами. Концентрация желатина, используемая для инактивации (0,1%), определялась экспериментально в соответствии с литературными данными о применении желатина медицинского в тест-системах ИФА для диагностики ряда инфекционных заболеваний [33,34]. Использование желатина медицинского позволяет сократить материальные затраты примерно в 10 раз.

Пример 1.

Для проведения анализа готовят разведения образцов сывороток крови 1:400 и 1:800, сыворотки разводят фосфатным буфером, имеющим следующий состав: буфер фосфатно-солевой pH 7,2, 0,02М, 5,68 г Na₂HPO₄, 6,24 г NaH₂PO₄, 11,2г NaCI в 2 л H₂O + 1 мл твин-20 или твин-80.

В лунки планшета после иммобилизации антигена и инактивации желатином вносят по 100 мкл исследуемой сыворотки по два повтора для каждого разведения. Планшеты инкубируют 2 ч при 37^oC, после инкубации 3-4 раза отмывают от несвязавшихся компонентов фосфатным буфером с добавлением детергента. В каждую лунку вносят по 100 мкл меченных ферментом антител, рабочее разведение конъюгата готовят используя фосфатный буфер с добавлением детергента и 0,1%-ного желатина, планшеты инкубируют 1,5 ч при 37^oC, затем отмывают, как описано выше. В лунки планшета вносят по 70 мкл субстрат-индикаторного раствора, содержащего 0,04% ортофенилендиамина и 5 мкл 33% H₂О₂ в расчете на 10 мл фосфатно-цитратного буфера pH 5,0. Фосфатно-цитратный буфер готовят при смешивании 49,3 мл 0,2М двузамещенного фосфорнокислого натрия (1,42 г на 50 мл H₂O) и 50,7 мл 0,1М лимоннокислого натрия (2,1 г на 100 мл H₂O). Планшеты выдерживают 20 мин при комнатной температуре в темноте для развития цветной реакции, затем добавляют в каждую лунку по 30 мкл 50н H₂SO₄ для остановки реакции. Результаты учитывают с помощью спектрофотометра, оптическую плотность измеряют при длине волны 492 нм. Одновременно измеряют оптическую плотность в лунках, содержащих контроли:
контроль специфического связывания: 100 мкл положительной сыворотки (сыворотка от больного псевдотуберкулезом с бактериологически подтвержденным диагнозом) + 100 мкл конъюгата + 70 мкл субстрат-индикаторного раствора + 30 мкл H₂SO₄;
контроль отрицательный: 100 мкл сыворотки здорового донора + 100 мкл конъюгата + 70 мкл субстрат-индикаторного раствора + 30 мкл H₂SO₄; контроль неспецифического связывания: 100 мкл буферного раствора + 100 мкл конъюгата + 70 мкл субстрат-индикаторного раствора + 30 мкл H₂SO₄.

Результат считают положительным, если отношение значений оптической плотности в лунках со специфической сывороткой к значению оптической плотности в лунках с нормальной сывороткой было больше или равно 2,1.

Для исследования диагностических качеств и специфичности ИФА на основе порина обследовано 190 больных в возрасте от 1 года 7 мес до 14 лет; из них 126 – больные псевдотуберкулезом; 43 – вирусными гепатитами А и В; 21 – с этиологически расшифрованными кишечными инфекциями. Верификация указанных заболеваний проводилась с учетом клинико-эпидемиологических, бактериологических и/или специфических серологических исследований. Контрольную группу составили 47 практически здоровых человек (I и IIA групп здоровья), сопоставимых по возрасту и полу с обследуемыми больными.

Для определения диагностического титра сравнивали величины отношений значений оптической плотности сывороток больных псевдотуберкулезом и здоровых людей (F_on/F_зд при различных разведениях сывороток, где F_on/=F_c+F_ф;
F_с – значение оптической плотности специфической реакции антиген/антитело (антитела – контрольная положительная сыворотка);
F_ф – значение оптической плотности неспецифической фоновой реакции;
F_зд – значение оптической плотности сыворотки здорового донора.

Для разведений исследуемой сыворотки 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600 эти величины оказались соответственно равны 4,0; 4,5; 4,6; 3,5 (фиг. 1). Разведение сыворотки, при котором соотношение F_on/F_зд оказалось наибольшим, приняли за диагностическое.

Таким образом, за диагностический титр в ИФА на основе порина могут быть приняты разведения 1: 400 или 1:800. При разведении сывороток менее 1:400 увеличивается неспецифическое взаимодействие антигена с белками контрольных сывороток, а при разведении сывороток более 1:800 уменьшается специфическое взаимодействие антигена с антителами.

При исследовании сывороток крови 10 больных острой дизентерией, 6 – сальмонеллезом, 5 – протеозом, 23 – острым вирусным гепатитом А и 20 – острым вирусным гепатитом В с помощью ИФА на основе порина антитела к возбудителю псевдотуберкулеза не были обнаружены ни в одном случае.

Таким образом, ИФА на основе порина обладает высокой специфичностью и не дает перекрестных реакций с антителами к возбудителям наиболее распространенных и сходных по клинике с псевдотуберкулезом заболеваний.

При обследовании больных псевдотуберкулезом уровень специфических антител зарегистрирован в пределах 0,52 – 2,23 единиц оптической плотности, что достоверно отличалось от контрольных значений (0,1 -0,3 единиц оптической плотности) (фиг.2).

Следовательно, ИФА на основе порина является чувствительным методом диагностики псевдотуберкулеза.

Для определения эффективности ИФА на основе порина использовали параллельную постановку РНГА с сухим антигенным псевдотуберкулезным эритроцитарным диагностикумом. При сравнительном анализе динамики уровня специфических антител в сыворотках крови больных при использовании ИФА на основе порина и РНГА выявлено следующее. На 1-й неделе заболевания с помощью ИФА на основе порина специфические антитела были определены в 59,7% случаев, а средний показатель оптической плотности составил 1,16 единиц, при постановке РНГА у этих же больных диагностические уровни антител были выявлены в 28,1% случаев. В остальных 31,6% реакций специфические антитела в РНГА определялись в титре 1:50 – 1:100 (т.е. были отрицательными), но на 2-й неделе заболевания в этой группе было отмечено увеличение титров антител до диагностических (в 2-4 раза от исходного). На 2-й неделе болезни ИФА на основе порина выявил диагностические уровни антител в 99,2% случаев (средний показатель оптической плотности был равен 1,27 единиц), а РНГА – в 85,7% (титр 1:200 – 1:800). На 3-4 неделях процент положительных реакций в ИФА на основе порина составил 98,9% (средний показатель оптической плотности 1,34 единиц), в РНГА – 77,7% (титры антител 1:100 – 1:1600) (фиг. 3). Обобщенный анализ данных исследования показывает, что при постановке ИФА на основе порина уровень антител к Y. pseudotuberculosis в диагностических значениях зарегистрирован в 96,2% случаев, а в РНГА – в 57,7%, в том числе на первой неделе заболевания эффективность ИФА на основе порина превысила показатели РНГА почти в 2 раза (59,7% и 28,1% соответственно).

Следовательно, ИФА на основе порина является высокоэффективным методом диагностики псевдотуберкулеза, позволяющим диагностировать данное заболевание как в ранние, так и в более поздние сроки.

Таким образом, иммуноферментный анализ на основе белка порина, выявляющий специфические антитела к Yersinia pseudotuberculosis всех серовариантов в сыворотках крови больных псевдотуберкулезом в разведениях 1:400 и 1:800, является достаточно чувствительным, эффективным и специфичным методом диагностики псевдотуберкулеза, позволяет диагностировать заболевание как в ранние, так и в поздние сроки болезни. Использование в реакции желатина медицинского вместо дорогостоящих реагентов (альбумин, нормальная сыворотка и др.) делает анализ более доступным для медицинской практики.

Литература

5. Кузьмин А. В. Микробиологические и эпидемиологические особенности псевдотуберкулеза в Приморском крае в современный период: Дис. канд. мед. наук.-Владивосток, 1997.

8. Сомов Г.П. Дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка.-М.:Медицина, 1979.-С.75-76.

9. Сомов Г.П., Покровский В.И., Беседнова Н.Н. Псевдотуберкулез.-М.:Медицина, 1990.-С.80-81.

11. Сомов Г. П., Покровский В.И., Беседнова Н.Н. Псевдотуберкулез.-М.: Медицина,1990.- С. 166; С.211.

13. Сомов Г. П. Дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка.-М.:Медицина, 1979.- С.152-158.

16. Опыт применения иммуноглобулинового эритроцитарного препарата для ранней лабораторной диагностики псевдотуберкулеза /М.В. Дулатова, В.С. Антонов, С. Н. Головачева и др.Журн. микробиологии, эпидемиологии, иммунобиологии.-1992.-N4.-С.55-57.

22. Сомов Г.П., Покровский В.И., Беседнова Н.Н. Псевдотуберкулез. -М.: Медицина,1990.-С.216-217.

23. Королюк А.М. Серологическая диагностика псевдотуберкулеза (скарлатино-подобной лихорадки). -Дис… канд.мед.наук. -Л.,1971.

24. Сомов Г. П., Покровский В.И., Беседнова Н.Н. Псевдотуберкулез.-М.: Медицина, 1990.-С.217-218.

25. Сомов Г.П., Покровский В.И., Беседнова Н.Н. Псевдотуберкулез. -М.: Медицина,1990.-С.222.

27. Сбойчаков В. Б. Применение твердофазного иммуноферментного анализа для диагностики псевдотуберкулеза: Дис. канд.мед.наук.- Л., 1986.

31. Теория и практика иммуноферментного анализа /А.М. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев, Е.М. Гаврилова. -М.:Высшая школа, 1991.-С. 214.

Формула изобретения

Способ диагностики псевдотуберкулеза, включающий определение специфических антител в сыворотке крови больного методом твердофазного иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что в качестве антигена используют видоспецифический белок порин из внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis, за диагностический титр принимают разведения сыворотки 1 : 400 и 1 : 800, в качестве реагента для предотвращения неспецифического связывания используют 0,1%-ный раствор медицинского желатина и результат считают положительным при отношении значений оптической плотности специфической сыворотки к значению оптической плотности нормальной сыворотки больше или равно 2,1.

РИСУНКИ