Патент на изобретение №2248755

(54) СПОСОБ ПРОГНОЗА ОФТАЛЬМОГЕРПЕСА

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии. Способ обеспечивает повышение частоты и сокращение времени прогноза офтальмогерпеса. Проводят определение содержания фактора некроза опухоли в острый период заболевания, при этом фактор некроза опухоли определяют в слезной жидкости на 11-15 день от начала герпетической офтальмоинфекции, при его содержании в пределах 176-250 пкг/мл прогноз течения заболевания оценивают как благоприятный, а от 300 пкг/мл и более – как неблагоприятный.

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано в медицинской практике для прогноза течения офтальмогерпеса.

Способы прогноза офтальмогерпеса основаны на изучении иммунопатологических изменений при этом заболевании, сопровождающихся нарушениями числа и спектра субпопуляций лимфоцитов крови и изменениями цитокинового статуса больного (В.Б.Мальханов, 1997; A.Biglino, 1996).

Известен способ прогноза офтальмогерпеса (В.Б.Мальханов, Т.Н.Куренкова, А.Э.Бабушкин. Офтальмологический журнал, 1981, №3, с.142-143) путем определения субпопуляций лимфоцитов методом розеткообразования с эритроцитами барана. Недостатками этого способа являются его трудоемкость, субъективность в оценке результатов и небольшое число одновременно проводимых исследований.

О характере течения и его прогнозе судят по функциональной активности клеток крови, определяемой по уровню синтеза ими цитокинов, одним из которых является фактор некроза опухоли (ФНО-). Данный цитокин проявляет пирогенные свойства, манифестирует ответ острой фазы воспаления и влияет на индукцию аутоиммунных реакций.

Наиболее близким по технической сущности является “Способ профилактики послеоперационных осложнений при проникающих корнеосклеральных ранениях глаза” (О.С.Слепова с соавт. Вестник офтальмологии, 1998, №3, с.28-32), авторами которого показана патогенетическая роль одного из цитокинов – ФНО- при однократном определении его содержания в сыворотке крови и слезной жидкости у больных при корнеосклеральных ранениях.

Недостатком данного способа является то, что авторы прогнозировали инфекционные осложнения при проникающих корнеосклеральных ранениях глаза по содержанию фактора некроза опухоли в сыворотке крови больных, что является инвазивным методом. Согласно этому способу в результате определения содержания фактора некроза опухоли в сыворотке крови пациентов прогноз осложнений после корнеосклеральных ранений осуществляется в более поздние сроки (до 1,5 лет), а частота эффективности прогноза составляет 25-75% случаев.

Техническим результатом изобретения является повышение частоты и сокращение времени прогноза течения офтальмогерпеса на основе определения содержания фактора некроза опухоли в слезной жидкости у больных в острый период (на 11-15 день от начала заболевания) герпетического кератита.

Технический результат достигается путем определения содержания фактора некроза опухоли в слезной жидкости в острый период заболевания, отличающийся тем, что выявление содержания фактора некроза опухоли в слезной жидкости на 11-15 день от начала заболевания в пределах 176-250 пкг/мл оценивают как благоприятный прогноз течения офтальмогерпеса, а при его концентрации от 300 пкг/мл и более – как неблагоприятный.

Преимуществом предлагаемого способа прогноза течения герпеса глаза является определение содержания ФНО- в слезной жидкости в острый период (на 11-15 день) офтальмогерпеса. Подтверждением предлагаемого способа прогноза является совпадение показателей концентрации исследуемого цитокина в слезной жидкости с клиническим течением офтальмогерпеса в среднем более чем в 92% случаев.

Способ осуществляют следующим образом.

Слезную жидкость забирают микропипеткой из конъюнктивального мешка в количестве 1 мл.

Определение уровня прововоспалительного ФНО-, в слезной жидкости больных проводят твердофазным иммуноферментным методом с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента с использованием тест-систем ProCon (ООО “Протеиновый контур”, С-Петербург).

В микропланшет с иммобилизованными антителами вносят по 100 мкл стандартов ФНО- и по 100 мкл исследуемых образцов слезной жидкости. Планшет инкубируют 1 час при +37°С при непрерывном встряхивании, затем трижды промывают буфером и дважды дистиллированной водой. Проводят полную аспирацию оставшейся жидкости.

В каждую ячейку микропланшета вносят по 100 мкл конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена, разведенного буфером. Планшет инкубируют в течение 30 мин при +20-25°С при непрерывном встряхивании. Жидкость из ячеек удаляют и трижды промывают буфером, затем дважды дистиллированной водой. Планшет сушат путем постукивания по поверхности лабораторного стола, покрытого фильтровальной бумагой.

Во все лунки планшета вносят по 100 мкл раствора субстрата с красителем. Микропланшет инкубируют в течение 10-15 минут при комнатной температуре в защищенном от прямых лучей месте на шейкере. Наблюдается развитие голубой окраски. Реакцию останавливают добавлением 50 мкл серной кислоты в каждую лунку. Общее время постановки исследования 2,5-3 часа.

Учет результатов проводят с использованием автоматического фотометра “Multiscan” при длине волны 450 нм, устанавливают нулевое поглощение по лунке со стандартом 0. Результаты выражают в пкг/мл. Нормальный уровень исследуемых цитокинов в слезной жидкости у практически здоровых лиц (контрольная группа), как правило, не превышает 125 пкг/мл.

У 63 больных офтальмогерпесом было изучено содержание прововоспалительного ФНО- в слезной жидкости в острый период заболевания. Слезную жидкость забирали микропипеткой из конъюнктивального мешка в количестве 1 мл.

Определение уровня ФНО- в слезной жидкости больных проводили твердофазным иммуноферментным методом с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента.

В микропланшет с иммобилизованными антителами вносили по 100 мкл стандартов ФНО- и по 100 мкл исследуемых образцов слезной жидкости больных. Планшет инкубировали 1 час при +37°С при непрерывном встряхивании, затем трижды промывали буфером и дважды дистиллированной водой. Проводили полную аспирацию оставшейся жидкости.

В каждую ячейку микропланшета вносили по 100 мкл конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена, разведенного буфером. Планшет инкубировали в течение 30 мин при +20-25°С при непрерывном встряхивании. Жидкость из ячеек удаляли и трижды промывали буфером, затем дважды дистиллированной водой. Планшет сушили путем постукивания по поверхности лабораторного стола, покрытого фильтровальной бумагой.

Во все лунки планшета вносили по 100 мкл раствора субстрата с красителем. Микропланшет инкубировали в течение 10-15 минут при комнатной температуре в защищенном от прямых лучей месте на шейкере. Наблюдали развитие голубой окраски. Реакция останавливалась добавлением 50 мкл серной кислоты в каждую лунку.

Учет результатов проводили с использованием автоматического фотометра “Multiscan” при длине волны 450 нм, устанавливая нулевое поглощение по лунке со стандартом 0. Результаты выражали в пкг/мл.

У 34 (53,9%) из 63 больных содержание ФНО- в слезной жидкости на 11-15 день от начала заболевания было выявлено в пределах 176-250 пкг/мл. При этом у 31 (91,2%) из них клинически заболевание протекало благоприятно, и к концу 3-й недели воспалительный процесс был купирован. У 3 (8,8%) больных течение офтальмогерпеса характеризовалось как неблагоприятное, т.к. в течение 3-х недель сохранялась воспалительная реакция с постепенным ее переходом в глубокие слои роговицы. Лишь к концу 4-й недели было отмечено стихание воспалительного процесса в глазу.

У 29 (46,1%) из 63 больных офтальмогерпесом концентрация ФНО- в слезной жидкости в этот же период заболевания составляла 300 пкг/мл и более. При этом неблагоприятное течение герпетической офтальмоинфекции (более 30 дней) наблюдали у 27 (93,1%) из них, у 2 (6,9%) отмечали непродолжительное (до 14 дней) благоприятное течение.

Таким образом, предлагаемый способ прогноза офтальмогерпеса являлся правильным у 58 из 63 больных, что было достоверно в 92% случаев.

Пример 1. Больной У. находился на стационарном лечении по поводу герпетического древовидного кератита. Определение цитокинов в слезной жидкости проводилось по выше описанной методике. В разгар заболевания на 12 сутки содержание ФНО- в слезной жидкости было равно 376,2 пкг/мл, на основании чего прогнозировали неблагоприятное течение. Действительно, в динамике развития заболевания, несмотря на проводимое противовирусное лечение, было отмечено поражение глубоких слоев роговицы с вовлечением в воспалительный процесс сосудистой оболочки. Был поставлен окончательный клинический диагноз: язва роговицы (герпетическая), острый иридоциклит. Больной находился на стационарном лечении 27 дней. Таким образом, высокое содержание ФНО- в слезной жидкости (376,2 пкг/мл) в острой стадии свидетельствует о неблагоприятном прогнозе течения офтальмогерпеса.

Пример 2. Больной К. Диагноз: краевой герпетический кератит. Определение цитокинов в слезной жидкости и сыворотке крови проводилось по выше описанной методике. На 15 день от начала заболевания содержание провоспалительного ФНО- в слезной жидкости – 185 пкг/мл. На основании установленного в пределах выше указанного интервала (176-250 пкг/мл) значения ФНО- в слезной жидкости больного прогнозировали благоприятное течение офтальмогерпеса. Стихание воспалительного процесса, резорбцию инфильтрата роговицы, отмечали уже к 19 суткам после начала заболевания, глубокие оптические среды глаза были спокойны, что свидетельствует о подтверждении ранее предположенного благоприятного прогноза развития офтальмогерпеса.

Таким образом, предлагаемый способ прогноза офтальмогерпеса позволяет оценить характер течения этого заболевания по изменению содержания ФНО- в слезной жидкости пациентов. Прогноз течения заболевания является благоприятным при уровне ФНО-, в слезной жидкости в пределах 176-250 пкг/мл и неблагоприятным – при его концентрации от 300 пкг/мл и выше.

Формула изобретения

Способ прогноза офтальмогерпеса путем определения содержания фактора некроза опухоли в острый период заболевания, отличающийся тем, что фактор некроза опухоли определяют в слезной жидкости на 11-15-й день от начала герпетической офтальмоинфекции, при его содержании в пределах 176-250 пкг/мл прогноз течения заболевания оценивают как благоприятный, а от 300 пкг/мл и более – как неблагоприятный.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 01.07.2005

Извещение опубликовано: 27.01.2007 БИ: 03/2007