Патент на изобретение №2248395
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/17/ПАНАМА/99/242(Н3N2) ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ВЗРОСЛЫХ
(57) Реферат:
Изобретение относится к области биотехнологии. Вакцинный штамм А/17/Панама/99/242 (H3N2) – реассортант, полученный путем скрещивания эпидемического вируса А/Панама/2007/99 (H3N2) с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) – донором аттенуации, безвредным для взрослых. Штамм А/17/Панама/99/242 (H3N2) активно размножается в развивающихся куриных эмбрионах при оптимальной температуре 33-34°С, характеризуется температурочувствительностью и холодоадаптированностью. Реассортант унаследовал от эпидемического вируса два гена, кодирующих поверхностные белки (гемагглютинин и нейраминидазу) и шесть генов, кодирующих негликолизированные белки от донора аттенуации. Штамм А/17/Панама/99/242 (H3N2) ареактогенен для взрослых при интраназальном введении и удовлетворяет показателям иммуногенности. Вакцинный штамм А/17/Панама/99/242 (H3N2) по показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым Фармакопейной статьей ФС 42-3569-98 к вакцинным штаммам для живой гриппозной вакцины для интраназального применения для взрослых. 1 ил., 2 табл.
Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики эпидемического гриппа среди взрослых живой интраназальной гриппозной вакциной из штамма А/17/Панама/99/242 (H3N2). Известный вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Сидней/97/76 (H3N2) – прототип [1] – утратил антигенную актуальность и вследствие этого не сможет вызвать защитную реакцию во время эпидемии гриппа, вызванной штаммом, аналогичным вирусу гриппа А/Панама/2007/99 (H3N2). Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма актуальной антигенной разновидности на основе эпидемического вируса А/Панама/2007/99 (H3N2). Вакцинный штамм А/17/Панама/99/242 (H3N2) получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Панама/2007/99 (H3N2) с холодоадаптированным штаммом А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) – донором аттенуации – с последующей селекцией в присутствии антисыворотки к вирусу А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Донор аттенуации – холодоадаптированный температурочувствительный штамм вируса гриппа А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых [2]. Вакцинный штамм является температурочувствительным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 33°С и 40°С составляет 6,3 Ig ЭИД50/0,2 мл) и холодоадаптированным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 33°С и 25°С – 2,9 Ig ЭИД50/0,2 мл). Один из двух поверхностных белков вакцинного штамма – гемагглютинин (НА) – в РТГА идентичен вирусу А/Панама/2007/99 (H3N2), антисывороткой к которому полностью нейтрализуется. Методом рестрикционного анализа ДНК копий генов [3] установлено, что вакцинный штамм А/17/Панама/99/242 (H3N2) унаследовал все шесть генов, кодирующих внутренние белки (РВ1, РВ2, PA, NP, М, NS) от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), а второй из двух генов, кодирующих поверхностные белки – нейраминидазу (NA) – от эпидемического вируса А/Панама/2007/99 (H3N2). Рестрикционный метод основан на амплификации участков РНК длиной около 150-300 нуклеотидов, включающих уникальные нуклеотидные последовательности, характерные только для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), но не для современных эпидемических вирусов гриппа. Обработка амплифицированных фрагментов ДНК специфическими эндонуклеазами (рестриктазами) с последующим электрофорезом обработанных рестриктазами фрагментов ДНК в 1,7%-ном агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл этидиума бромида, позволяет четко дифференцировать принадлежность генов исследуемых реассортантных штаммов к эпидемическому вирусу или донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). На фиг.1 в качестве примера представлена рестрикция ДНК-копии фрагмента гена NS эндонуклеазой Сас I. 1-я и 7-я дорожки – ДНК маркер молекулярного веса IX; 2-я и 4-я дорожки – донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2); 3-я и 5-я дорожки – кандидат в вакцинные штаммы А/17/Панама/99/242 (H3N2); 6-я дорожка – эпидемический вирус А/Панама/2007/99 (H3N2). В NS гене донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) в позиции нуклеотида 798 имеется замена G Эпидемические вирусы имеют на этом участке сайт рестрикции для экзогенной рестриктазы Сас I. У донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) этот рестрикционный сайт отсутствует. Т.о., обработка всех исследуемых фрагментов ДНК данным ферментом приводит к разрезанию участка гена NS на два более мелких фрагмента, если он происходит от эпидемического вируса. В случае NS гена донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) расщепления не происходит. Результаты рестрикционного анализа всех генов вакцинного штамма А/17/Панама/99/242 (H3N2) представлены в табл.1. Таким образом, представленный вакцинный штамм А/17/Панама/99/242 (H3N2) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью поверхностных белков эпидемического вируса А/Панама/2007/99 (H3N2), структурой генома, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека, характерной для донора аттенуации. Морфология штамма – полиморфная, типичная для вируса гриппа. ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 33-34°С в течение 48 часов – 8,0 Ig ЭИД50/0,2 мл. Гемагглютинирующая активность -1:512. Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз). Пример получения вакцинного штамма А/17/Панама/99/242 (H3N2) представлен в прилагаемом паспорте. ПАСПОРТ ШТАММА 1. Название штамма – А/17/Панама/99/242 (H3N2) 2. Метод получения – реассортация; характеристика родительских вирусов: а) эпидемический вирус – А/Панама/2007/99 (H3N2); б) донор аттенуации – А/Ленинград/134/17/57 (H2N2); 3. Количество пассажей – 6 в процессе рекомбинации 4. Характеристика штамма до лиофилизации: а) оптимальные условия репродукции – 33°С, 48 часов; б) гемагглютинирующая активность -1:512; в) инфекционная активность – 8.0 Ig ЭИД50/0,2 мл; г) чувствительность к ингибиторам – ингибиторорезистентный; д) разность в показателях инфекционной активности при 33°С и 40°С – 6,3 Ig ЭИД50/0,2 мл; е) разность в показателях инфекционной активности при 33°С и 25°С – 2,9 Ig ЭИД50/0,2 мл. ж), структура генома реассортанта: – гены от эпидемического вируса – НА, NA – гены от донора аттенуации – РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS 5. Характеристика штамма после лиофилизации: а) дата лиофилизации – 24 января 2002 г. б) объем материала в ампуле -1,0 мл. 6. Антигенная специфичность а) гемагглютинина в РТГА – идентичен вирусу А/Панама/2007/99 (H3N2), хорьковой антисывороткой к которому полностью нейтрализуется; б) нейраминидазы – идентична вирусу А/Панама/2007/99 (H3N2) по данным ПЦР-рестрикционного анализа ДНК-копий генов. 7. Безвредность для мышей при подкожном и внутрибрюшинном введении – безвреден. ШТАММ А/17/ПАНАМА/99/242 (H3N2) АРЕАКТОГЕНЕН ДЛЯ ВЗРОСЛОГО КОНТИНГЕНТА Пример. При вакцинации 57 взрослых лиц интраназально рекомбинантным вакцинным штаммом А/17/Панама/99/242 (H3N2) с инфекционной активностью 8,0 1д ЭИД50/0,2 мл в разведении 1:2 в объеме 0,5 мл сильных температурных реакций с повышением температуры свыше 38,5° не наблюдалось. Слабые температурные реакции (до 37,5°С) были отмечены у одного человека (1.75%) и средние температурные реакции с кратковременным повышением температуры в диапазоне 37,6-38,5°С были также отмечены у одного человека (1,75%). В контрольной группе из 45 лиц, получивших плацебо, сильных температурных реакций с повышением температуры свыше 38,5°С и средних реакций с повышением температуры в диапазоне 37,6-38,5°С не наблюдалось. Слабые температурные реакции (до 37,5°С) были отмечены у одного человека (2,22%) (табл.2). Таким образом, вакцинный штамм А/17/Панама/99/242 (H3N2) по показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым Фармакопейной статьей ФС 42-3569-98 к вакцинным штаммам для живой гриппозной вакцины для интраназального применения для взрослых. ЛИТЕРАТУРА 1. Киселева И.В., Александрова Г.И., Руденко Л.Г. и др. Штамм вируса гриппа А/17/Сидней/97/76 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых. Патент РФ №2159812 от 27.11.00. Опубл. БИ 2000. – №33. 2. Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. -СПб.: Наука. – 1994. – 151с. Формула изобретения
Штамм вируса гриппа А/17/Панама/99/242 (H3N2) ГИСК №140 (Государственный институт стандартизации и контроля им. Л.А.Тарасевича), используемый для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых.
РИСУНКИ
QB4A Регистрация лицензионного договора на использование изобретения
Лицензиар(ы): Государственное учреждение “Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины” Российской академии медицинских наук
Лицензиат(ы): Федеральное государственное унитарное предприятие “Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам “Микроген” Министерства здравоохранения Российской Федерации
Договор № РД0027211 зарегистрирован 01.10.2007
Извещение опубликовано: 10.11.2007 БИ: 31/2007
* ИЛ – исключительная лицензия НИЛ – неисключительная лицензия
|
||||||||||||||||||||||||||
A по сравнению с современными эпидемическими штаммами, приведшая к аминокислотной замене метионина эпидемических вирусов на изолейцин у донора аттенуации.
