Патент на изобретение №2247991
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СРЕДСТВО, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И СПОСОБ ДЛЯ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ АНТИГЕНА ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА
(57) Реферат:
Изобретение относится к медицине и касается средства, способа его получения и способа экспресс-диагностики вируса клещевого энцефалита. Средство представляет собой 2%-ный коагглютинирующий реагент, полученный путем добавления к 10%-ному растворенному в дистиллированной деионизованной воде стафилококковому реагенту равного количества 0,1%-ного высокоочищенного и высокоавидного иммуноглобулина против клещевого энцефалита, проведения сенсибилизации в течение 1-1,5 часов при температуре 25-30°С, ресуспендирования осадка в 0,15 М растворе хлорида натрия рН 5,4-5,5 и доведения полученного коагглютинирующего реагента до 2%-ного содержания. Способ экспресс – диагностики антигена вируса клещевого энцефалита заключается в нанесении на предметное стекло 15-20 мкл исследуемого материала, добавлении в него равного количества средства, для экспресс-диагностики, тщательном перемешивании посредством покачивания предметного стекла и визуальном определении через 2-7 минут по феномену коагглютинации наличия антигена вируса клещевого энцефалита. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 3 табл.
Изобретение относится к биотехнологии и медицине, касается производства медицинских иммунобиологических препаратов и лабораторной диагностики возбудителя инфекционного заболевания человека, в частности средства и способа экспресс-диагностики (индикации) вируса клещевого энцефалита. Известно средство и способ экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита путем иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием приготовленного иммуноглобулина против клещевого энцефалита и его конъюгата с пероксидазой хрена [1]. Однако данный способ длителен по времени (6-7 часов), трудоемок, так как необходимо выполнение пяти этапов исследования, а также при выполнении способа требуется дорогостоящее оборудование. Ближайшим по технологической сущности (прототипом) к предлагаемому нами способу экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита является способ путем проведения реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) ближайшим средством и способом для экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита (прототипом) служит эритроцитарный диагностикум и способ его получения. Эритроцитарный диагностикум представляет собой 3%-ную взвесь эритроцитов барана, фиксированных формалином или акролеином, обработанных танином и сенсибилизированных иммуноглобулином к вирусу клещевого энцефалита [2, 3]. Эритроцитарный диагностикум получают следующим образом: 3%-ную взвесь фиксированных акролеином или формалином и тонизированных бараньих эритроцитов сенсибилизируют 0,05-0,1%-ным иммуноглобулином против клещевого энцефалита при 56°С в течение 30 минут. Затем центрифугируют 10 минут при 2000 оборотах в минуту, дважды отмывают в 1%-ной НКС с последующим центрифугированием, осадок ресуспендируют наполнителем: ФБР рН 7,2, пептон – 3%, сахароза – 1%. Сенсибилизированные эритроциты специфически связываются с антигеном возбудителя в исследуемом материале, что визуально выражается в проявлении феномена гемагглютинации в РНГА. Способ РНГА ставят микрометодом в общем объеме 75 мкл, используя пластины U системы “Такачи” фирмы “Мэтримпэкс” или любые другие планшеты, предназначенные для серологических анализов. Способ РНГА ставят следующим образом: Во все лунки планшета раскапывают по 25 мкл 1%-ного раствора НКС. В первую лунку каждого ряда вносят по 25 мкл антигена (К+, К-, исследуемый материал). Перемешивают и последовательно переносят во все лунки соответствующих рядов. Получают разведения антигенов с коэффициентом 2, затем во все лунки добавляют по 25 мкл 1%-ной НКС и 1%-ную взвесь эритроцитарного диагностикума. Проводят контроль эритроцитов на спонтанную агглютинацию: в 2-3 лунки вносят по 50 мкл 1%-ной НКС и по 25 мкл 1%-ной взвеси эритроцитарного диагностикума. Планшет встряхивают в горизонтальной плоскости для перемешивания ингредиентов и помещают при температуре (20±2)°С на 2-2,5 часа или на 1-1,5 часа при температуре (37±2)°С. При отсутствии агглютинации в контролях эритроцитов реакцию учитывают по 4-крестовой системе визуально. Положительным результатом в РНГА считают агглютинацию эритроцитов на +3 +4. За титр антигена принимают его максимальное разведение, давшее гемагглютинацию на +3 +4. РНГА с К+ должна быть положительной, с К- – отрицательной. Однако данное средство, способ его получения и способ экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита имеет следующие недостатки: – длительность приготовления эритроцитарного диагностикума, чувствительность которого зависит от многих факторов: физиологического состояния эритроцитов барана, чистоты акролеина (или формалина), танина, температурных режимов каждого этапа технологического процесса и, наконец, от чистоты, специфической активности и авидности иммуноглобулина; – выполнение способа РНГА занимает несколько часов, при этом теряется время и падает эффективность экстренной серопрофилактики пострадавшим, которая наиболее высока в первые сутки после укуса инфицированного клеща; – способ РНГА недостаточно чувствителен и тем самым не дает желаемого результата, что является одним из важных условий для экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита. Задачей, решаемой предлагаемым изобретением, является сокращение времени, повышение чувствительности, доступность и экономичность способа при сохранении высокой его специфичности. Поставленная задача решается средством для экспресс-диагностики, содержащим 2%-ный коагглютинирующий реагент, полученный путем добавления к 10%-ному растворенному в дистиллированной деионизованной воде стафилококковому реагенту равного количества 0,1%-ного высокоочищенного и высокоавидного иммуноглобулина против клещевого энцефалита, проведения сенсибилизации в течение 1-1,5 часов при температуре 25-30°С, ресуспендирования осадка в 0,15 М растворе хлорида натрия рН 5,4-5,5 и доведения полученного коагглютинирующего реагента до 2%-ного содержания и способом экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита путем нанесения на предметное стекло 15-20 мкл исследуемого материала и добавления в него равного количества средства, для экспресс-диагностики, содержащего 2%-ный коагглютинирующий реагент, полученный путем сенсибилизации 10%-ного стафилококкового реагента высокоавидным и высокоочищенным иммуноглобулином против клещевого энцефалита, тщательного перемешивания посредством покачивания предметного стекла и визуального определения через 2-7 минут по феномену коагглютинации наличия антигена вируса клещевого энцефалита и его количества по 3-х балльной системе. В проанализированной авторами патентной и научно-медицинской литературе не найдено данной совокупности отличительных признаков, приводящих к новому техническому результату, и они явным образом не следуют для специалиста из уровня техники. Способ, средство для экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита и способ его получения были апробированы в лабораторных условиях. Таким образом, данные технические решения соответствуют критериям изобретения: “новизна”, “изобретательский уровень”, “промышленно применимо”. Средство для экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита готовят следующим образом: Сухой 10%-ный стафилококковый реагент растворяют в дистиллированной деионизованной воде, выдерживают 1,5-2,0 часа при комнатной температуре для набухания и прибавляют к 10%-ному растворенному в дистиллированной деионизованной воде стафилококковому реагенту равное количество 0,1%-ного высокоочищенного и высокоавидного иммуноглобулина против клещевого энцефалита и проводят сенсибилизацию в течение 1-1,5 часов при температуре 25-30°С, затем центрифугируют 20 минут при 3000 оборотах в минуту, осадок ресуспендируют в 0,15 М растворе хлорида натрия рН 5,4-5,5 до 2%-ного содержания коагглютинирующего реагента, добавляют мертиолят натрия до 0,001%-ного содержания и сохраняют при температуре (7±3)°С в течение 4-6 месяцев. Способ экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита осуществляют следующим образом: На предметное стекло наносят 15-20 мкл исследуемого материала и добавляют в него равное количество средства для экспресс-диагностики, содержащее 2%-ный коагглютинирующий реагент, полученный путем сенсибилизации 10%-ного стафилококкового реагента высокоавидным и высокоочищенным иммуноглобулином против клещевого энцефалита, тщательно перемешивают посредством покачивания предметного стекла и визуально определяют через 2-7 минут по феномену коагглютинации наличие антигена вируса клещевого энцефалита по 3-х балльной системе. “3+” – образование агглютината и интенсивное просвечивание реакционной смеси (реакция резко положительная); “2+” – отчетливое просветление смеси (реакция положительная); “+” – маловыраженное просветление смеси (реакция слабоположительная); “-” – отсутствие просветления (реакция отрицательная). Предлагаемый способ позволяет выявить как наличие, так и количественное содержание антигена вируса клещевого энцефалита в исследуемом материале. Для количественного определения делают разведения исследуемого материала на 0,15 М растворе хлорида натрия с коэффициентом 2 и наносят их по 15-20 мкл на предметное стекло, добавляют равное количество средства для экспресс-диагностики, содержащее 2%-ный коагглютинирующий реагент, полученный путем сенсибилизации 10%-ного стафилококкового реагента высокоавидным и высокоочищенным иммуноглобулином против клещевого энцефалита, перемешивают путем покачивания предметного стекла и через 2-7 минут визуально по феномену коагглютинации определяют титр антигена вируса клещевого энцефалита в исследуемом материале по 3-х балльной системе. Положительным результатом предлагаемого способа считают коагглютинацию на +3 +2. За титр антигена (1 коагглютинирующая единица – КОАЕ) принимают его последнее разведение, давшее интенсивную коагглютинацию (на +2). Предлагаемый нами способ и средство для экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита основаны на феномене коагглютинации при взаимодействии специфических антител и антигена. Для подтверждения специфичности предлагаемого способа и средства для экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита титровали материал (субстрат), содержащий и не содержащий антиген вируса клещевого энцефалита (см. табл.1). Предлагаемый способ и средство для экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита сравнивали по чувствительности, определяя количество (титр) антигена вируса клещевого энцефалита путем разведения с коэффициентом 2 исследуемого материала на 0,15 М растворе хлорида натрия со способами экспресс-диагностики ИФА и РНГА. При этом титровали один и тот же материал, содержащий антиген вируса клещевого энцефалита, тремя способами: путем ИФА, РНГА и предлагаемым (см. табл.2). Исследуемым материалом служила вакцина клещевого энцефалита на разных стадиях технологического процесса. Из приведенного материала следует, что предлагаемый способ экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита, выполненный с помощью средства, содержащего 2%-ный коагглютинирующий реагент, полученный путем сенсибилизации 10%-ного стафилококкового реагента высокоавидным и высокоочищенным иммуноглобулином против клещевого энцефалита, специфичен, по количеству выявленного антигена вируса клещевого энцефалита и минимальному количеству белка Е во много раз чувствительнее способа РНГА и в среднем в 2-4 раза чувствительнее способа ИФА. Таким образом, предлагаемый способ экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита, выполненный с помощью средства, содержащего 2%-ный коагглютинирующий реагент, полученный путем добавления к 10%-ному растворенному в дистиллированной деионизованной воде стафилококковому реагенту равного количества 0,1%-ного высокоочищенного и высокоавидного иммуноглобулина против клещевого энцефалита, проведения сенсибилизации в течение 1-1,5 часов при температуре 25-30°С, ресуспендирования осадка в 0,15 М растворе хлорида натрия рН 5,4-5,5 и доведения полученного коагглютинирующего реагента до 2%-ного содержания, как и способы ИФА и РНГА, специфичен, но превосходит их по чувствительности и во много раз по экспрессности (время выполнения по ИФА – 6-7 часов, по РНГА 1.5-2.5 часа, по предлагаемому способу 2-7 минут), при простоте выполнения и экономичности (табл.3). Список литературы 1. Лаптакова М.М., Морякин А.В., Лаврова Н.А. Разработка и применение иммунопероксидазной тест-системы для индикации вируса клещевого энцефалита. Сб. Актуальные вопросы медицинской биотехнологии и прикладной иммунологии. – Томск. – 1990. – том 36. – с 50-65. 2. Подоплекина Л.Е., Унгер Т.Н. Диагностикум эритроцитарный к вирусу клещевого энцефалита иммуноглобулиновый крысинный сухой для РНГА (эритроцитарный диагностикум к вирусу клещевого энцефалита). – ВФС 42. – 2874 – 97. 3. Подоплекина Л.Е., Унгер Т.Н. Экспериментально-производственный регламент № 527 – 95 Диагностикум эритроцитарный к вирусу клещевого энцефалита иммуноглобулиновый крысиный сухой для РНГА. НИИВС НПО “Вирион”.
Формула изобретения
1. Средство для экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита, содержащее 2%-ный коагглютинирующий реагент, полученный путем сенсибилизации 10%-ного стафилококкового реагента высокоочищенным и высокоавидным иммуноглобулином против клещевого энцефалита. 2. Способ приготовления средства для экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита, заключающийся в сенсибилизации, центрифугировании приготовленной взвеси, удалении надосадочной жидкости, ресуспендировании осадка и приготовлении реагента, отличающийся тем, что до сенсибилизации к 10%-ному растворенному в дистиллированной деионизованной воде стафилококковому реагенту добавляют высокоочищенный и высокоавидный иммуноглобулин против клещевого энцефалита, проводят сенсибилизацию в течение 1-1,5 ч, затем ресуспендируют осадок в 0,15 М растворе хлорида натрия и доводят полученный коагглютинирующий реагент до 2%-ного содержания. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что сенсибилизацию проводят при температуре 25-30°С. 4. Способ по п.2, отличающийся тем, что к 10%-ному растворенному в дистиллированной деионизованной воде стафилококковому реагенту добавляют равное количество 0,1%-ного высокоочищенного и высокоавидного иммуноглобулина против клещевого энцефалита. 5. Способ по п.2, отличающийся тем, что осадок ресуспендируют в растворе 0,15 М хлорида натрия рН 5,4-5,5. 6. Способ экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита путем исследования материала, определения наличия и/или количественного содержания антигена вируса клещевого энцефалита путем разведения в 0,15 М растворе хлорида натрия, отличающийся тем, что на предметное стекло наносят исследуемый материал или его разведения в количестве 15-20 мкл, добавляют равное количество средства для экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита, содержащего 2%-ный коагглютинирующий реагент, полученный путем сенсибилизации 10%-ного стафилококкового реагента высокоочищенным и высокоавидным иммуноглобулином против клещевого энцефалита, тщательно перемешивают путем покачивания предметного стекла и через 2-7 мин визуально определяют по феномену коагглютинации наличие и/или количество антигена вируса клещевого энцефалита.
MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 22.05.2005
Извещение опубликовано: 27.01.2007 БИ: 03/2007
NF4A Восстановление действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение
Дата, с которой действие патента восстановлено: 27.05.2008
Извещение опубликовано: 27.05.2008 БИ: 15/2008
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
