Патент на изобретение №2152995

(54) СПОСОБ ОЧИСТКИ РИБОНУКЛЕАЗЫ

(57) Реферат:

Изобретение относится к технологии производства ферментов. Способ очистки включает растворение и фильтрацию производственного высола рибонуклеазы. Фильтрат подвергают сорбции на изопористом макросетчатом сульфокатионите, являющемся сополимером полистирола и монохлорэтилового эфира, при рН 4,5 – 6,5 с последующей элюцией фермента. В качестве элюента используют 30 – 60% этанол или изопропанол в 0,1 – 0,5 н. HCl. Способ позволяет сократить время технологического цикла очистки рибонуклеазы при увеличении выхода и повышении качества препарата. 1 з.п. ф-лы, 1 ил.,1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к производству ферментов.

Нуклеазы получают из различных источников, например из животного и растительного сырья [1], а также из культуральной жидкости микроорганизмов [2]. Известны способы выделения рибонуклеаз путем экстракции с последующим фракционированием сернокислым аммонием и индивидуальной очисткой фермента, основанной на использовании хроматографических методов [1, 2, 3,] Однако получаемые нуклеазы неспецифичны и иммунотоксичны (например, рибонуклеаза из микроорганизмов), а применяемые способы их выделения и очистки дорогостоящие и не могут быть использованы в промышленном масштабе.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является способ очистки рибонуклеазы из поджелудочной железы крупного рогатого скота [4] . Фермент выделяют путем экстракции с последующим фракционированием сульфатом аммония других гидролитических ферментов (дезоксирибонуклеаза, трипсин и химотрипсин) по мере возрастания степени насыщения раствора, т.е. получают соответствующий производственный высол. Очистку производственного высола рибонуклеазы осуществляют следующим образом: осадок растворяют в дистиллированной воде, обрабатывают кизельгуром и фильтруют. Полученный осадок отделяют, а из фильтрата осаждают балластные белки путем добавления насыщенного раствора сульфата аммония с pH 2.5. Затем добавляют 1н NaOH до значения pH 7 и быстро снижают прибавлением 1н H₂SO₄ до значения pH 4.8. После 20-минутного отстаивания смесь фильтруют, обрабатывают инфузорной землей и снова фильтруют. Осадок балластов отделяют, а из полученного фильтрата осаждают рибонуклеазу. Для этого в прозрачном фильтрате устанавливают значение pH 4.2 путем добавления 5н H₂SO₄. Осаждение ведут кристаллическим сульфатом аммония в течение 2-3 часов, полученную смесь фильтруют. Осадок растворяют в дистиллированной воде, устанавливают значение pH 4, полученный раствор нагревают до 95-97^oC и выдерживают в течение 10 минут, затем охлаждают и перемешивают при 20^oC в течение 1 часа. Выпавший осадок балластов отфильтровывают и отбрасывают, а фильтрат, содержащий рибонуклеазу, подвергают диализу. Очищенный раствор фермента поступает на стерильную фильтрацию и лиофильную сушку.

Указанный способ, выбранный в качестве прототипа, обладает рядом недостатков, главными из которых являются:
– многостадийность;
– длительность проведения производственного процесса, что приводит к большим потерям и низкому выходу целевого продукта;
– использование методов очистки (высаливание, диализ), которые не дают достаточной степени очистки (см. чертеж), что сказывается на таких показателях, как токсичность и пирогенность препарата.

Задачей предлагаемого изобретения является сокращение времени технологического цикла очистки рибонуклеазы из производственного высола, увеличение ее выхода и улучшение качества препарата.

Указанная задача достигается использованием способа очистки рибонуклеазы, который включает растворение и фильтрацию производственного высола рибонуклеазы, причем фильтрат подвергают сорбции на изопористом макросетчатом сульфокатионите, являющемся сополимером полистирола и монохлордиэтилового эфира, при pH 4.5-6.5 с последующей элюцией фермента водно-спиртовым раствором с pH 2-3. В качестве элюента используют 30-60% этанол или изопропанол в 0.1-0.5 н. HCl. Способ осуществляется следующим образом: производственный высол рибонуклеазы растворяют в ацетатном буферном растворе с pH 4,5-6,5 и фильтруют. Фильтрат подают на ионообменную колонну с сорбентом со скоростью 50-150 мл/см² час. Снижение pH до 3-3,5 приводит к уменьшению равновесной емкости сорбции. Увеличение pH до 7-8 приводит к помутнению раствора, вызванного агрегацией белковых молекул. Увеличение и уменьшение скорости сорбции вне указанного интервала существенно не влияет на процесс. После окончания сорбции колонну промывают дистиллированной водой в количестве, равном свободному объему колонны. Затем осуществляют десорбцию рибонуклеазы со смолы путем подачи сверху вниз элюента со скоростью 25-50 мл/см² час. В качестве элюента используют подкисленный водно-спиртовой раствор с pH 2-3 и концентрацией спирта в элюенте 30-60% по объему. Увеличение скорости подачи элюента и изменение pH элюента больше 3,0 приводит к “размыванию” целевого пика, увеличению его объема, что не позволяет достичь достаточной для осаждения степени концентрирования целевого продукта. Увеличение концентрации спирта в элюенте больше 60% приводит к десорбции с ионита примесей и, как следствие, к ухудшению качества фермента. Во фракции элюата, содержащие более 10 мг/мл белка, определенного по методу Лоури, добавляют 1 н. NaOH до pH 7-8 и охлажденный спирт до полного осаждения целевого продукта.

Отличительными признаками предложенного способа от прототипа является сорбция рибонуклеазы из фильтрата на селективном ионите с последующей элюцией фермента, причем в качестве элюента используют подкисленный водно-спиртовой раствор.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. 100 г производственного высола рибонуклеазы растворяют в 2 л 0,1 М ацетатного буферного раствора с pH=4,5 и фильтруют на воронке Бюхнера. Отфильтрованный опалесцирующий раствор подают на ионообменную колонну, заполненную макросетчатым изопористым сульфокатионитом на основе полистирола в Н-форме в количестве 50 г. Скорость сорбции 150 мл/см² час. Затем сорбент промывают 200 мл дистиллированной воды и проводят десорбцию рибонуклеазы 30%-ным этанолом в 0,1 н. растворе HCl, подавая элюент сверху вниз со скоростью 75 мл/см² час, pH элюента 2,0. На выходе из колонны собирают фракции объемом 50 мл, в которых определяют содержание белка по методу Лоури. Фракции, содержащие более 10 мг/мл белка, объединяют, доводят pH элюата до 7-8 путем добавления 1 н. NaOH, добавляют этанол до полного осаждения целевого продукта.

Пример 2. 900 г производственного высола рибонуклеазы растворяют в 18 л 0,1М ацетатного буферного раствора с pH=6,5 и фильтруют на воронке Бюхнера. Сорбцию проводят как описано в примере 1, но со скоростью 100 мл/см² час. Затем сорбент промывают 2 л дистиллированной воды и проводят десорбцию рибонуклеазы со смолы 60%-ным этанолом в 0,5 н. растворе HCl, подавая элюент сверху вниз со скоростью 50 мл/см² час, pH элюента 3.0. Далее действуют аналогично примеру 1.

Пример 3. Сорбцию, промывку сорбента и десорбцию рибонуклеазы проводят аналогично примеру 2, однако в качестве элюента используют водно-изопропанольный раствор той же концентрации. Далее действуют как описано в примере 1.

Предлагаемый способ может быть использован для очистки рибонуклеаз, полученных из различных источников, например из растительного сырья, а также из микроорганизмов.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет выделить целевой продукт высокого качества с хорошим выходом.

Положительный эффект от предложенного технического решения состоит в следующем:
1) Уменьшается время технологического цикла очистки производственного высола рибонуклеазы в 5 раз (см. таблицу).

2) Сокращаются потери целевого продукта и увеличивается съем фермента с единицы сырья в 3.7-4 раза (см. таблицу).

3) Улучшается качество готового препарата (см. чертеж) и увеличивается удельная активность препарата в 2 раза (см.таблицу).

Литература
1. Патент 1703688 РФ МПК C 12 N 9/22. Способ очистки нуклеазы из проростков ячменя / Козлов А.В., Ковалева Л.Б., Мячин Ф.В. Опубл. в БИ N 1, 1992 г.

2. Патент 1495377 РФ МПК C 12 N 9/22. Способ получения РНК-азы Н из E. coli / Чичкова Н.В., Пейсениекс В.Э., Залите И.К. Опубл. в БИ N 27, 1989 г.

3. Патент 1392902 РФ МПК C 12 N 9/22. Способ выделения и очистки бактериальной эндонуклеазы из культуральной жидкости Serratia marcescens / Банникова Г.Е., Варламов В.П., Рогожин С.В. Опубл. в БИ N 17, 1990 г.

4. Тугунов С.С., Константинов В.Л., Манойлов С.Е., Дмитриева В.А. Заводское производство аморфных и кристаллических лечебных препаратов ферментов трипсина, химотрипсина и рибонуклеазы из панкреатической железы / Труды Ленинградского химико-фармацевтического института, 1967, вып.20, – с.9-18

Формула изобретения

1. Способ очистки рибонуклеазы, включающий растворение и фильтрацию производственного высола, отличающийся тем, что фильтрат подвергают сорбции на изопористом макросетчатом сульфокатионите, являющемся сополимером полистирола и монохлордиэтилового эфира, при pH 4,5 – 6,5 с последующей элюцией фермента водно-спиртовым раствором с pH 2 – 3.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве элюента используют 30 – 60% этанол или изопропанол в 0,1 – 0,5 н HCl.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 08.12.2005

Извещение опубликовано: 10.12.2006 БИ: 34/2006