Патент на изобретение №2246966

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ -ЭКДИЗОНА

(57) Реферат:

Изобретение относится к способам выделения биологически активных веществ из растительного сырья. Способ получения -экдизона путем экстрагирования растительного сырья вида Serratula coronata, заключающийся в том, что выжимают и отфильтровывают сок из свежесобранных в фазу бутонизации листьев растения Serratula coronata, концентрируют и экстрагируют его этилацетатом, экстракт упаривают, охлаждают, фильтруют смесь кристаллов 20-гидроксиэкдизона и -экдизона, с последующим растворением в ацетоне и добавлением фосфорно-молибденовой кислоты, полученную смесь 2,3:20,22-диацетонида 20-гидроксиэкдизона и 2,3-ацетонида -экдизона разделяют колоночной хроматографией, выделенный 2,3-ацетонид -экдизона гидролизуют, реакционную смесь экстрагируют, экстракт упаривают и выделяют кристаллы -экдизона путем хроматографирования на колонке. Способ позволяет повысить производительность процесса, снизить удельный расход органических растворителей и энергозатрат, а также повысить выход целевого продукта – -экдизона.

Изобретение относится к способам выделения биологически активных веществ из растительного сырья, в частности способам выделения фитоэкдистероидов, а именно -экдизона – природного гормона линьки насекомых, используемого в медицине и сельском хозяйстве.

Максимальная концентрация -экдизона зафиксирована в листьях Serratula coronata в фазу бутонизации [Ануфриева Э.Н., Володин В.В., Носов А.М., Гарсиа М., Лафон Р.. Состав и содержание экдистероидов в растениях и культуре ткани Serratula coronata. II Физиология растений, 1998, 45, №8, 382-389].

Известно два способа получения -экдизона из растения рода Serratula coronata. Согласно одному из них [Авторское свидетельство СССР №1146050, А 61 К 35/78, 1985], первичную экстракцию сырья проводят метанолом с одновременным упариванием в экстракторе вакуум-циркуляционной установки и последующим удалением сопутствующих веществ жидкостной экстракцией и очисткой продукта жидкостно-адсорбционной колоночной хроматографией на оксиде алюминия, в результате чего получают трудноразделимую смесь -экдизона и 20-гидроксиэкдизона. Содержание -экдизона в полученной смеси определяется с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ). Способ включает девять последовательных операций: три экстракции, три выпарки, одну операцию фильтрации, одну операцию растворения и колоночную адсорбционную хроматографию. Время осуществления способа 66-70 часов. Недостатками указанного способа являются использование операций жидкостно-жидкостной экстракции, которые требуют многократности их повторения и минимум трехкратного объема экстрагента к экстрагируемому объему на каждой операции экстракции, длительность, трудоемкость и многостадийность процесса, значительная энергоемкость способа вследствие трех операций выпарки и длительности работы вакуумно-циркуляционной установки. К тому же -экдизон в чистом виде по данному способу выделен не был. Судя по содержанию -экдизона в полученной смеси с 20-гидроксиэкдизоном (определено методом ТСХ), выход -экдизона (при условии его полного извлечения из этой смеси, например, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)) не превысит 0.006% от веса воздушно сухой массы травы.

Согласно другому способу [Патент Российской Федерации №2063763, А 61 К 35/78, 1996] для получения -экдизона и 20-гидроксиэкдизона надземную часть растения рода Serratula измельчают и экстрагируют дистиллированной водой при температуре не выше 100°С в течение до 1 часа. Полученный экстракт пропускают через слой твердого гидрофобного сорбента, например активированного угля, диасорба, полисорба, получая трудноразделяемую смесь -экдизона и 20-гидроксиэкдизона. Для их последующего разделения используют ВЭЖХ, что является серьезным недостатком этого метода, обусловливающим низкий выход -экдизона (0.03% от веса воздушно-сухой массы травы). К недостаткам этого метода следует также отнести использование больших объемов органических растворителей и большие энергетические затраты.

Целью предполагаемого изобретения является упрощение способа выделения -экдизона, повышение производительности процесса, а также снижение удельного расхода органических растворителей и энергозатрат.

Существенным отличительным признаком предлагаемого способа, позволяющим решить поставленные задачи, является исключение первичной экстракции целевого продукта из растительного сырья с помощью органических растворителей или воды. Вместо экстракции применяют выжимание сока с последующей фильтрацией, что позволяет сразу получить концентрат экдистероидов. Это значительно упрощает способ, увеличивает производительность процесса, сокращает энергозатраты, уменьшает расход органических растворителей и трудоемкость способа и, как следствие, значительно удешевляет весь процесс. Также исключается длительный процесс сушки растительного сырья. Такой прием существенно упрощает процесс выделения смеси -экдизона и 20-гидроксиэкдизона. Принципиально важной отличительной особенностью предлагаемого способа является найденный эффективный путь разделения смеси -экдизона (1) и 20-гидроксиэкдизона (2) превращением их в ацетониды (выдерживание в ацетоновом растворе в присутствии фосфорномолибденовой кислоты при комнатной температуре в течение 30 мин). При этом 20-гидроксиэкдизон (2) превращается в 2,3:20,22-диацетонид (4), а -экдизон (1), в молекуле которого отсутствует 20-гидроксильная группа, образует 2,3-ацетонид (3) (схема). Как и следовало ожидать, моноацетонид (3) и диацетонид (4) существенно различаются по полярности и вследствие этого легко разделяются с помощью колоночной хроматографии. Последующий кислотный гидролиз полученного индивидуального ацетонида (3), легко протекающий в растворе 70%-ной уксусной кислоты при комнатной температуре в течение 1 часа, приводит к целевому продукту – -экдизону (1) с выходом 0,13% в пересчете на вес сухой травы, т.е. в 4-20 раз выше, чем в известных способах.

Способ осуществляется следующим образом.

Из надземной части растений вида Serratula coronata, собранных в фазу бутонизации, выжимают сок (с помощью соковыжималки, пресса или других устройств), который фильтруют, и фильтрат (прозрачно-желтого цвета) концентрируют до 0,1 от первоначального объема, полученный концентрат экстрагируют этилацетатом, экстракт упаривают (при температуре 40-65°С и пониженном давлении) до 0,25 от первоначального объема экстракта, охлаждают до комнатной температуры, и отфильтровывают смесь кристаллов -экдизона (1) и 20-гидроксиэкдизона (2), которую растворяют в ацетоне, выдерживают 30 мин в присутствии фосфорно-молибденовой кислоты, получая смесь 2,3-ацетонида -экдизона (3) и 2,3:20,22-диацетонида 20-гидроксиэкдизона (4). Хроматографирование полученной смеси на колонке с силикагелем приводит к индивидуальным 2,3-ацетониду (3) и диацетониду (4). Гидролиз 2,3-ацетонида -экдизона (3) 70% уксусной кислотой протекает легко и приводит к -экдизону, выход которого в расчете на вес воздушно сухого исходного сырья травы Serratula coronata составляет 0,13%.

Пример осуществления способа

Из 30 кг надземной части растения рода Serratula coronata, собранного в фазу бутонизации, в день сбора выжимают сок, который фильтруют, получая 14.8 л прозрачно-желтого фильтрата. После его концентрирования путем упаривания на роторном испарителе получают 1,5 л концентрата. Из концентрата экстрагируют этилацетатом (3×10 л), экстракты объединяют и упаривают до 2,0 л, охлаждают и фильтруют выпавшие кристаллы (46.4 г) смеси -экдизона и 20-гидроксиэкдизона, к которой добавляют 1,0 л ацетона и 0,2 г фосфорно-молибденовой кислоты. Суспензию перемешивают при комнатной температуре до образования гомогенной реакционной массы (30 мин). Реакционную смесь упаривают на роторном испарителе до 150 мл, добавляют 250 мл 1%-ного раствора МаНСОз и экстрагируют этилацетатом (3×1,5 л). Экстракт упаривают досуха и остаток (55,3 г) хроматографируют на колонке с 1,2 кг SiO₂ (элюент-СНСl₃-МеОН, 25:1), получая 5,78 г 2,3-ацетонида -экдизона (3) (т. пл. 114-116°С) и 47.2 г 2,3:20,22-диацетонида 20-гидроксиэкдизона (4) (т.пл. 234-23 5°С). К полученному 2,3-ацетониду -экдизона (3) (5,78 г) добавляют 20 мл 70% уксусной кислоты и перемешивают при комнатной температуре до полной конверсии субстрата (1,0 ч, контроль ТСХ). Реакционную смесь разбавляют водой (60 мл), экстрагируют -бутанолом (3×150 мл), объединенные органические слои промывают 75 мл насыщенного раствора NaCl и упаривают в вакууме. Остаток (4.8 г) хроматографируют на колонке с 100 г SiO₂ (элюент – СНСl₃-МеОН, 10:1), получая 4.42 г -экдизона (1), (т.пл. 239°С, ИК-, УФ-, ЯМР ¹H и ¹³С идентичны приведенным ранее [Lafont, R.; Wilson, I.D. The Ecdysone Handbook, Vol. I, Third Edition, The Chromatographic Society; Nottingham, U.K., 2000, p.207]. Выход в пересчете на воздушно-сухое сырье составляет 0.13%.

Формула изобретения

Способ получения -экдизона путем экстрагирования растительного сырья рода Serratula и выделения целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве сырья используют выжатый и отфильтрованный сок из свежесобранных в фазу бутонизации листьев растения вида Serratula coronata, концентрируют и экстрагируют этилацетатом, экстракт упаривают, охлаждают до комнатной температуры и фильтруют смесь кристаллов 20-гидроксиэкдизона и -экдизона с последующим растворением в ацетоне и добавлением фосфорно-молибденовой кислоты, полученную смесь 2,3:20,22-диацетонида 20-гидроксиэкдизона и 2,3-ацетонида -экдизона разделяют колоночной хроматографией на силикагеле, выделенный 2,3-ацетонид -экдизона гидролизуют в кислой среде, реакционную смесь экстрагируют н-бутанолом, экстракт упаривают и выделяют кристаллы -экдизона путем хроматографирования на колонке.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 05.11.2005

Извещение опубликовано: 27.01.2007 БИ: 03/2007