Патент на изобретение №2246732

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЦИТОКИНОВ, ПОДАВЛЯЮЩИХ Т-ЛИМФОЦИТЫ НОВОРОЖДЕННЫХ

(57) Реферат:

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано для оценки состояния иммунной системы новорожденного ребенка. Сущность изобретения состоит в том, что проводят реакцию бласттрансформации, определяют пролиферацию Т-лимфоцитов, активированных антителами к CD3 в присутствии интерлейкина-7 (АКТ ИЛ-7) и в присутствии интерлейкина-7 и дексаметазона (АКТ ИЛ-7 Д), вычисляют индекс действия дексаметазона как отношение АКТ ИЛ-7 к АКТ ИЛ-7 Д, при этом значение индекса действия дексаметазна более 1,2 свидетельствует о повышенной продукции цитокинов, подавляющих пролиферацию Т-лимфоцитов новорожденных. Техническим результатом является разработка способа, позволяющего определить функциональный дефект иммунной системы, характерный для периода новорожденности.

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для оценки состояния иммунной системы новорожденного ребенка.

Известно, что цитокины являются группой белков, секретируемых различными клетками и регулирующих кроветворение, развитие иммунной системы, иммунный ответ и процессы воспаления. Большинство цитокинов полифункциональны. Тем не менее, можно выделить несколько групп цитокинов по их основным биологическим свойствам – стимуляторы гемопоэза (интерлейкин-3 (ИЛ-3), эритропоэтин, колониестимулирующие факторы); стимуляторы клеточных форм иммунного ответа и воспаления (ИЛ-2, ИЛ-9, ИЛ-12, интерфероны, факторы некроза опухоли); стимуляторы гуморального иммунного ответа и аллергических реакций (ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6) и цитокины, подавляющие иммунный ответ и воспаление (ИЛ-10, отчасти ИЛ-4, прогестерон-индуцируемый фактор, пептидные гуморальные факторы плаценты). Соотношение продуцируемых цитокинов во многом определяют характер и эффективность иммунного ответа.

Цель изобретения – определение функционального дефекта иммунной системы, характерного для периода новорожденности и обусловленного повышенной продукцией факторов с иммуносупрессорной активностью.

Способ основан на способности синтетического аналога гормонов коры надпочечников – дексаметазона – подавлять продукцию широкого спектра цитокинов лимфоцитами человека в культуре. В результате этого дексаметазон подавляет пролиферацию активированных Т-лимфоцитов. В то же время, рекомбинантный человеческий ИЛ-7 способен полностью компенсировать созданный дексаметазоном дефицит цитокинов, стимулирующих размножение Т-лимфоцитов. В результате, введение дексаметазона в культуру мононуклеарных клеток пуповинной крови с Т-лимфоцитами, активированными антителами к молекуле CD3 в присутствии ИЛ-7, не приводит к подавлению пролиферации в культурах с нормальной продукцией цитокинов или же существенно увеличивает пролиферацию клеток в культурах, в которых до действия дексаметазона наблюдалась усиленная продукция подавляющих пролиферацию факторов. Предлагаемый метод позволяет оценить суммарную биологическую активность гуморальных факторов, продуцируемых клетками крови новорожденных и подавляющих активность Т-лимфоцитов.

Способ осуществляют следующим образом.

Забор пуповинной крови осуществляют после рассечения пуповины из плацентарного отрезка пуповины в стерильный флакон объемом 50 мл, содержащий 1 мл раствора гепарина на среде ДМЕМ или физиологическом растворе. Концентрация раствора гепарина 100 ед/мл. Объем отбираемой пробы крови 5-10 мл. Взятая проба крови может храниться до 8 часов при +4°С.

Мононуклеарные клетки из пробы крови выделяют традиционным способом над слоем фиколл-верографина, фиколл-пака или гистопака с плотностью 1,077 г/мл в стерильных условиях. Выделенные мононуклеарные клетки дважды отмывают средой для культур клеток ДМЕМ осаждая клетки центрифугированием при 1500 об./мин в течение 10 мин. Перед вторым центрифугированием количество клеток подсчитывают в камере Горяева. После центрифугирования готовят суспензию клеток, содержащую 10⁶ клеток в 1 мл среды для культур клеток ДМЕМ с 10% эмбриональной телячьей сыворотки 584 мг/мл L-глутамина и 50 мг/мл гентамицина.

Суспензию клеток вносят в 15 лунок 96 луночных стерильных круглодонных планшетов для иммунологических реакций или 96-луночных плоскодонных планшетов для культур клеток. В первые 3 лунки не вносят дополнительных реагентов. Эти лунки служат негативным контролем (К).

В следующие 3 лунки микропипеткой вносят по 10 мкл раствора очищенных моноклональных антител ИКО-90 к молекуле CD3. Раствор моноклональных антител, как и растворы всех остальных реагентов, готовят на среде того же состава, что использовалась для приготовления суспензии клеток. Раствор не должен содержать консервантов (азида натрия, мертиолята и др.). Концентрация антител во вносимом растворе – 20 мкг/мл. Данные 3 лунки служат для оценки пролиферативного ответа Т-лимфоцитов на активацию через молекулу CD3 (АКТ). Активация Т-клеток через молекулу CD3 моделирует в поликлональном варианте активацию клеток антигеном при иммунном ответе.

В следующие 3 лунки вместе с 10 мкл раствора антител ИКО-90 вносят 10 мкл раствора натриевой соли фостфата дексаметазона. Концентрация раствора дексаметазона – 8 мкг/мл. Эти 3 лунки служат контролем действия дексаметазона на активированные Т-клетки (АКТ Д).

В следующие 3 лунки вносят по 10 мкл раствора антител ИКО-90, раствора ИЛ-7 и раствора натриевой соли фостфата дексаметазона (АКТ ИЛ-7 Д). Концентрация раствора дексаметазона – 8 мкг/мл.

На одном 96-луночном планшете можно засеять культуры из 6 образцов крови. Засеянные планшеты инкубируют при 37° С в атмосфере с 5% СО₂ (в СO₂-инкубаторе или в эксикаторе со свечой) в течение 72 часов. На последние 24 часа инкубации в засеянные лунки планшета вносят раствор меченного тритием метилтимидина по 0,5 мкКи на лунку. По окончании инкубации планшеты замораживают, оттаивают и переносят содержимое лунок на стекловолокнистве фильтры с помощью харвестера. Фильтры после тщательного высушивания переносят в сцинцилляционные флаконы с 5 мл сцинцилляционной жидкости. В качестве сцинцилляционной жидкости можно использовать ЖС-8 или раствор дефинилоксазола и дефинилоксазолил бензола на толуоле для спектроскопии. Радиоактивность фильтров определяют на сцинцилляционном счетчике (бета-1, СБС-2, Beckman). В результате получают значения пролиферации клеток в каждой лунке, выраженные в импульсах в мин. Значения, соответствующие лункам К, АКТ, АКТ Д, АКТ ИЛ-7 и АКТ ИЛ-7 Д усредняют.

Анализ результатов проводят следующим образом.

Результат реакции бласттрансформации в ответ на активацию Т-клеток через молекулу CD3 оценивают, вычисляя индекс стимуляции пролиферации – отношение средних значений пролиферации в лунках с антителами к CD3 к значению пролиферации в контрольных лунках (АКТ/К). Значение индекса стимуляции пролиферации менее 2 свидетельствует о низком пролиферативном ответе Т-клеток на активацию.

Продукцию подавляющих пролиферацию факторов оценивают, вычисляя индекс действия дексаметазона – отношение средних значений пролиферации в лунках с активированными клетками в присутствии ИЛ-7 к значению пролиферации в лунках с активированными клетками в присутствии ИЛ-7 и дексаметазона по формуле:

Индекс действия дексаметазона = АКТ ИЛ-7: АКТ ИЛ-7 Д.

Значение индекса действия дексаметазона более 1,2 свидетельствует о повышенной продукции в культуре цитокинов, подавляющих пролиферацию Т-лимфоцитов.

Пример 1. Пациент М. Новорожденный с нормальным сроком внутриутробного развития (40 нед.), практически здоров. Мононуклеарные клетки пуповинной крови новорожденного разводили в среде ДМЕМ с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамином и гентамиционом до концентрации 10⁶ клеток в мл и по 200 мкл засевали в 15 лунок 96-луночного планшета для культур клеток без дополнительных реагентов (3 лунки – К), с моноклональными антителами ИКО-90 (3 лунки -АКТ), с моноклональными антителами и дексаметазоном (3 лунки – АКТ Д), с моноклональными антителами и ИЛ-7 (3 лунки – АКТ ИЛ-7) и с моноклональными антителами, ИЛ-7 и дексаметазоном (3 лунки – АКТ ИЛ-7 Д). Засеянные культуры клеток инкубировали 72 часа в СО₂-инкубаторе, меченный тритием метилтимидин вносили на последние 24 часа инкубации. Включение метки оценивали с помощью счетчика Beckman LS-230. Результаты оценки пролиферации:

К – 1004 импульса в мин

АКТ – 5347 импульсов в мин

АКТ Д – 480 импульсов в мин

АКТ ИЛ-7 – 5531 импульс в мин

АКТ ИЛ-7 Д – 4961 импульс в мин

Расчитываем индекс стимуляции пролиферации 5347/1004=5,33. Пролиферативный ответ Т-лимфоцитов на активацию удовлетворительный.

Расчитываем индекс действия дексаметазона на продукцию подавляющих пролиферацию факторов 4961/5531=0,9. Усиленной продукции цитокинов, подавляющих пролиферацию Т-клеток, не обнаружено.

Пример 2. Пациент В. Ребенок доношенный, в тяжелом клиническом состоянии. Клинический диагноз: “Респираторный дистресс-синдром, синдром аспирации мекония, осложненный двусторонней пневмонией, Перинатальная энцефалопатия гипоксического генеза, ПВК-1, гипохромная анемия средней степени, гемангиома грудной клетки справа”.

Мононуклеарные клетки пуповинной крови новорожденного разводили в среде ДМЕМ с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамином и гентамиционом до концентрации 10⁶ клеток в мл и по 200 мкл засевали в 15 лунок 96-луночного планшета для культур клеток без дополнительных реагентов (3 лунки – К), с моноклональными антителами ИКО-90 (3 лунки – АКТ), с моноклональными антителами и дексаметазоном (3 лунки – АКТ Д), с моноклональными антителами и ИЛ-7 (3 лунки – АКТ ИЛ-7) и с моноклональными антителами, ИЛ-7 и дексаметазоном (3 лунки – АКТ ИЛ-7 Д). Засеянные культуры клеток инкубировали 72 часа в СO₂-инкубаторе, меченный тритием метилтимидин вносили на последние 24 часа инкубации. Включение метки оценивали с помощью счетчика Beckman LS-230. Результаты оценки пролиферации:

К – 383 импульса в мин

АКТ – 362 импульсов в мин

АКТ Д – 468 импульсов в мин

АКТ ИЛ-7 – 1044 импульса в мин

АКТ ИЛ-7 Д – 3804 импульса в мин

Индекс стимуляции пролиферации 362/383=0,95. Пролиферативный ответ Т-лимфоцитов на активацию отсутствует.

Индекс действия дексаметазона на продукцию подавляющих пролиферацию факторов 3804/1044=3,64. Обнаружена усиленная продукция цитокинов, подавляющих пролиферацию Т-клеток. Делается заключение о подавленном ответе Т-лимфоцитов на активацию, причем, по крайней мере, одна из причин неудовлетворительного ответа Т-лимфоцитов – усиленная продукция лимфоцитами гуморальных факторов, угнетающих размножение лимфоцитов.

Метод применим в условиях специализированных иммунологических лабораторий НИИ и диагностических центров. Учитывая незначительный расход дорогостоящих препаратов (рекомбинантный человеческий интерлейкин-7), метод не является дорогостоящим.

Метод разработан и апробирован в лаборатории клеточной иммунологии Нижегородского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Акад. И.Н. Блохиной и применяется в этом институте для оценки состояния иммунной системы новорожденных, родившихся в роддомах №1 и 3 г.Нижнего Новгорода.

Формула изобретения

Способ определения продукции цитокинов, подавляющих пролиферацию Т-лимфоцитов новорожденных, заключающийся в том, что проводят реакцию бласттрансформации, определяют пролиферацию Т-лимфоцитов, активированных антителами к CD3 в присутствии интерлейкина-7 (АКТ ИЛ-7) и в присутствии интерлейкина-7 и дексаметазона (АКТ ИЛ-7 Д), вычисляют индекс действия дексаметазона как отношение АКТ ИЛ-7 к АКТ ИЛ-7 Д и значение индекса действия дексаметазона более 1,2 свидетельствует о повышенной продукции цитокинов, подавляющих пролиферацию Т-лимфоцитов новорожденных.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 22.04.2006

Извещение опубликовано: 10.05.2007 БИ: 13/2007