Патент на изобретение №2246727

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ДОКЛИНИЧЕСКОЙ СТАДИИ ЭПИЛЕПСИИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, а именно к психиатрии и неврологии, и может быть использовано как метод выявления скрытого эпилептогенеза, дающий возможность оценить степень его компенсированности или подвижности, позволяющий улучшить диагностику эпилепсии на ее доклинической стадии. Сущность изобретения заключается в том, что проводят электроэнцефалографический мониторинг с подсчетом фрактальной размерности флуктуации спектральной мощности и биохимическое тестирование пароксизмальной активности головного мозга с помощью тест-системы, позволяющей определить уровень в крови аутоантител к глутаматсвязывающему мембранному белку головного мозга, при этом дополнительно проводят оценку иммунного гомеостаза, определяют уровень общих тиоловых групп белков (SH-групп) в сыворотке крови калориметрическим методом, основанным на взаимодействии молекулярного йода со свободными сульфгидрильными группами белков, и спектрофотометрически оценивают содержание среднемолекулярных олигопептидов (СМП), причем значения SH-групп, равные 2,87-3,42 ммоль/л, и значения СМП, равные 2,89-3,38 г/л, в совокупности с другими показателями подтверждают наличие у больного доклинической стадии эпилепсии. Преимущество изобретения заключается в повышении точности диагностики. 3 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к психиатрии и неврологии, и может быть использовано как метод выявления скрытого эпилептогенеза, дающий возможность оценить степень его компенсированности или подвижности, позволяющий улучшить диагностику эпилепсии на ее доклинической стадии.

Наиболее близким к предложенному является способ диагностики доклинической стадии эпилепсии, включающий электроэнцефалографический мониторинг с подсчетом фрактальной размерности флуктуации спектральной мощности и биохимическое тестирование пароксизмальной активности головного мозга с помощью тест-системы (SU, Патент №2188575, кл. А 61 В 5/0476, 2001 г.).

Недостатком известного способа является недостаточная точность и информативность диагностики доклинической стадии эпилепсии.

Технической задачей настоящего изобретения является устранение указанных недостатков.

Это достигается тем, что в способе диагностики доклинической стадии эпилепсии, включающем электроэнцефалографический мониторинг с подсчетом фрактальной размерности флуктуации спектральной мощности и биохимическое тестирование пароксизмальной активности головного мозга с помощью тест-системы, позволяющей определить уровень в крови аутоантител к глутаматсвязывающему мембранному белку головного мозга, согласно изобретению проводят оценку иммунного гомеостаза, при этом дополнительно определяют уровень общих тиоловых групп белков (SH-групп) в сыворотке крови калориметрическим методом, основанным на взаимодействии молекулярного йода со свободными сульфгидрильными группами белков, и спектрофотометрически оценивают содержание среднемолекулярных олигопептидов (СМП), причем значения SH-групп, равные 2,87-3,42 ммоль/л, и значения СМП, равные 2,89-3,38 г/л, в совокупности с другими показателями подтверждают наличие у больного доклинической стадии эпилепсии (приводятся минимальные и максимальные значения SH-групп и СМП, определяемые у лиц с доклиническим эпилептогенезом).

Целью исследования явилось изучение особенностей иммунного статуса, в том числе оценка тиосульфидного звена антиоксидантной системы и состояния пептидного обмена на всех этапах эпилептогенеза.

Способ диагностики доклинической стадии эпилепсии осуществлялся следующим образом. Под наблюдением находилось 62 пациента с доклинической стадией эпилепсии (ДСЭ) в возрасте 15-44 лет, которые были разделены на 4 группы: 1 группу составили 14 пациентов, у которых диагностирована стадия регрессированного эпилептогенеза (РЭ), 2-ю – 16 больных с компенсированным эпилептогенезом (КЭ), 3-ю – 15 – с нарастающим (НЭ) и 4-ю – 17 – с декомпенсированным эпилептогенезом (ДЭ). В качестве контроля выделены 2 группы: в 1 группу вошли 68 больных эпилепсией с клинически регистрируемыми на протяжении последнего года приступами – клиническая стадия эпилепсии (КСЭ), во 2-ю – 30 практически здоровых волонтеров (ЗВ). Период наблюдения за больными составил 5 лет. Диагноз ДСЭ подтверждался анамнестическими данными. Так, у каждого из наблюдаемых пациентов определялось одно из следующих характерных состояний: 1) фебрильные судороги в детстве; 2) пароксизмальные эпилептические нарушения на электроэнцефалограмме (ЭЭГ); 3) один неспровоцированный эпилептический приступ. У 8 (11,6%) больных в анамнезе выявлена наследственная отягощенность эпилепсией, а у 54 (87,4%) при помощи МРТ обнаружены морфологические изменения головного мозга. Объективная оценка состояния эпилептогенеза осуществлялась при помощи метода анализа ЭЭГ с подсчетом фрактальной размерности флуктуации спектральной мощности -ритма (SU, Патент №2156607, кл. А 61 В 5/0476, 2000 г.) и метода биохимического тестирования пароксизмальной активности головного мозга с помощью тест-системы, позволяющей определять уровень в крови аутоантител к глутаматсвязывающему мембранному белку головного мозга (SU, Патент №2189776, кл. А 61 В 5/0476, 2002 г.). Метод фрактального анализа ЭЭГ позволяет выявлять скрытые изменения биоэлектрической активности головного мозга в доклинической стадии эпилепсии. Вычисляется основная характеристика результатов фрактального анализа ЭЭГ – фрактальная размерность флуктуации квадрата амплитуды -ритма (D). Как видно из таблицы 1, значение D в контрольной группе здоровых волонтеров составило 0,53±0,06 у.е., а целом по группе больных с ДСЭ – колебалось от 0,60 до 0,77 у.е., что отражает нарушение протекания биоэлектрических процессов головного мозга. Между тем в 1 группе больных D равнялось 0,70±0,02 у.е., во 2-й – 0,64±0,03 у.е., в 3-й – 0,74±0,01 у.е., в 4-й – 0,81±0,01 у.е., в то время как у больных с КСЭ – 0,83±0,02 у.е. Биохимическое тестирование пароксизмальной активности головного мозга показывает степень выраженности аутоиммунного дефекта на разных стадиях эпилептогенеза. Значение титра пароксизмальной активности до 90 у.е. (85,04±2,61 у.е.) соответствовало периоду ЗВ, от 91 до 157 у.е. – в целом по группе больных с ДСЭ; 118,84±3,17 у.е. – определялось у больных 1 группы, 115,17±4,21 – 2 группы, 149,87±3,56 – 3 группы, 171,15±6,18 – 4 группы и у больных с КСЭ – достигало 191,16 у.е. (в среднем 166,74±7,42).

, ИЛ-1, ИЛ-2) в культуральной среде (супернатантах суточных культур мононуклеаров периферической крови) и сыворотке крови (Кетлинский С.А., Калинина И.М. Иммунология для врачей. – Санкт-Петербург, 1998. – С.121-144). Для этих целей использовали тест-системы, разработанные в ГосНИИОЧБ и производимые фирмой “Протеиновый контур” (Санкт-Петербург). Уровни сывороточных иммуноглобулинов G, А, М определялись методами иммунопреципитации в геле по G. Mancini, a E – иммуноферментным методом. Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) в крови исследовали методом преципитации в полиэтиленгликоле (Методы диагностики нарушений гемостаза при ангиопатиях с тромбогенными проявлениями: Пособие для врачей/ Под ред. Л.П.Папаян и соавт. – Санкт-Петербург, 1996). Для более полной и объективной оценки гомеостаза у всех пациентов были изучены тиоловые группы белков, которые являются составной частью антиоксидантной системы, а также среднемолекулярные олигопептиды (СМП). Уровень общих тиоловых групп белков (SH-групп) в сыворотке крови определяли калориметрическим методом, основанным на взаимодействии молекулярного йода со свободными сульфгидрильньми группами белков. Содержание среднемолекулярных олигопептидов оценивали спектрофотометрически. Принцип метода состоит в депротеинизации сыворотки трихлоруксусной кислотой, сорбции на силикагеле высокомолекулярных веществ и измерении среднемолекулярных соединений при двух длинах волн ( 260 Нм и 280 Нм). Статистическая обработка полученных результатов производилась на персональном IBM-совместимом компьютере. Сортировка и обработка данных осуществлялась с помощью прилагаемых пакетов статистических программ “Microsoft Excel”. Полученные данные представлены в виде средней арифметической величины “М” и средней ошибки “m”: М±m. Рассчитывалось количество изучаемых признаков в группах (“n”). Достоверность различий сопоставляемых совокупностей осуществлялось с использованием критериев Стьюдента и ².

При иммунологическом маркерном анализе установлено, что у больных с ДСЭ относительное и абсолютное содержание CD3+ и CD4+-клеток снижено по сравнению с показателями ЗВ. В то же время содержание СD8+-клеток умеренно повышено, и поэтому соотношение хелперы/супрессоры в 1,7 раза оказалось ниже, чем у здоровых волонтеров (см. табл.1). Содержание СD22+-клеток у больных также было понижено. Одновременно отмечалась тенденция к увеличению числа активированных СD25+-клеток. При оценке иммунного статуса больных в группах в зависимости от состояния доклинического эпилептогенеза обращало внимание дальнейшее снижение как Т-, так и В-клеточных показателей, но наиболее отчетливое в группе больных с ДЭ, показатели которых вплотную приблизились к таковым пациентов с КСЭ (см. табл.1). Так, если содержание общей популяции Т-лимфоцитов и Т-хелперов при регрессированном эпилептогенезе достоверно превышало показатели ЗВ в 28,6% и 42,9% наблюдений, то при декомпенсированном эпилептогенезе – в 70,6% и 76,5%, а у больных с КСЭ – в 70% и 80% соответственно. Результаты изучения В-клеточных маркеров выявили их гетерогенность. Среднее количество CD20+ при РЭ равнялось 15,1±1,8%, компенсированном – 17,3±2,1%, нарастающем – 18,7±2,1%, а при декомпенсированном – 19,6±3,4%. Причем при нарастающем и декомпенсированном эпилептогенезе содержание СD20-клеток статистически значимо (Р<0,001) превышало показатели ЗВ в 60% и 64,7% наблюдений. Одновременно зарегистрировано существенное увеличение (в 53,3% и 58,8% наблюдений соответственно) содержания клеток, экспрессирующих рецепторы к ИЛ-2 (CD25+).

Между тем, относительные и абсолютные показатели экспрессии CD22+ уменьшались. Как показано в таблице 1, при регрессированном эпилептогенезе их абсолютное содержание составило 0,33±0,02×10⁹/л, а декомпенсированном – более чем в 1,7 раза ниже. В целом по группе больных с КСЭ этот показатель был еще ниже (0,16±0,05×10⁹/л). У всех больных с ДСЭ выявлено увеличение сывороточной концентрации цитокинов. ФНО- в крови больных, как видно из таблицы 2, был выше, чем в группе ЗВ (р<0,05). В динамике течения патологического процесса уровень его неуклонно рос и у больных в стадии декомпенсации в 4 раза превысил таковой в группе ЗВ (37,2±5,4 ед/мл), составив 153,3±6,8 ед/мл. Высокая концентрация ФНО- обнаружена и в крови больных с КСЭ. Результаты исследования других цитокинов позволили установить, что доля больных с высокими значениями ИЛ-1, спонтанно и индуцировано продуцируемого мононуклеарными клетками периферической крови, увеличивается в зависимости от выраженности компенсации: регрессированный – компенсированный – нарастающий эпилептогенез. Активность ИЛ-1 (см. табл.2) особенно высокой оказалась при декомпенсированном эпилептогензе (37,5±2,4 ед/мл) и у больных эпилепсией с клинически регистрируемыми приступами (40,4±3,5 ед/мл). Продукция ИЛ-2 также выше была у пациентов при декомпенсированном эпилептогензе и с КСЭ (7,6±1,5 и 9,5±1,4 ед/мл), тогда как при РЭ и НЭ – ниже (5,8±1,2 и 6,2±1,4 ед/мл). Причем частота наблюдений с повышенным уровнем этих цитокинов увеличивалась соответственно стадии развития эпилепсии. ИЛ-1, как известно, стимулирует специфическое звено иммунитета, оказывая влияние на функциональную активность Т-лимфоцитов, повышая продукцию ИЛ-2, а также экспрессию рецептора для него. В связи с этим нами был проведен корреляционный анализ между активностью ИЛ-1 и содержанием клеток, экспрессирующих рецепторы к ИЛ-2. Обнаружена прямая зависимость между ИЛ-1 и СD25+-лимфоцитами (r=+0,70, р<0,001). Результаты изучения уровня иммуноглобулинов и ЦИК в ДСЭ показали, что концентрация IgA и IgM ниже, чем в группе ЗВ, и, наоборот, выше, чем у больных с КСЭ, но достоверно не отличалась при различных состояниях эпилептогенеза. Напротив, содержание IgG и IgE выше, чем у ЗВ (см. табл.2). Особенно выраженные отклонения от значений ЗВ зарегистрированы при изучении динамики IgE, содержание которого при регрессированном эпилептогенезе составило 197,54±7,12 мг/мл, нарастающем – 229,15±3,76 мг/мл, а декомпенсированном – 241,75±5,87 мг/мл. Прямо пропорционально росту иммуноглобулинов отмечалось увеличение уровня ЦИК (r+0,68, Р<0,01). Так, при компенсированном эпилептогенезе содержание ЦИК в 43,8% наблюдений существенно отличалось от таковых ЗВ (р<0,05), а при нарастающем и декомпенсированном – в 53,3% и 58,8% соответственно.

При исследовании уровня сульфгидрильных групп белков и среднемолекулярных олигопептидов в крови больных было обнаружено статистически значимое их отклонение от пациентов контрольных групп. Так, если у ЗВ уровень SH-групп в крови составил 2,81±0,02 ммоль/л, а СМП – 2,33±0,07 г/л, то в целом по группе больных с ДСЭ отмечено увеличение как SH-групп (3,19±0,04 ммоль/л), так и СМП (2,95±0,06 г/л), причем в 30,6% и в 32,3% (соответственно) – существенное (р<0,05). Обращала на себя внимание зависимость между параметрами АОС и пептидного обмена, с одной стороны, и звеньями эпилептогенеза – с другой. Вьмвлено увеличение средних значений уровня SH-групп в сыворотке крови с 2,92±0,05 ммоль/л у пациентов в стадии регрессированного эпилептогенеза, до 3,39±0,03 ммоль/л при декомпенсированном эпилептогенезе (р<0,05), что, как видно из таблицы 3, мало отличалось от показателей больных с клинической стадией эпилепсии. Следует отметить, что частота встречаемости повышенных значений SH-групп при регрессированном эпилептогенезе составила 11,8%, а при компенсированной в 2 раза выше, что на первых порах, вероятно, можно расценить как активацию защитных сил у пациентов этой группы, в ответ на возникающие изменения в иммунной системе. Подобная картина наблюдалась при изучении СМП, содержание которых достоверно увеличивалось с 2,45±0,05 г/л при РЭ до 3,31±0,07 г/л -при ДЭ (р<0,05), что мало отличалось показателей больных с КСЭ. Причем следует подчеркнуть, что число пациентов с отчетливо повышенными значениями (р<0,05) как SH-групп, так и СМП, неуклонно росло от 1-й к 4-й группе.

Таким образом, результаты проведенных исследований выявили глубокие нарушения показателей иммунологической реактивности у больных с доклинической стадией эпилепсии. Это касалось всех изучаемых нами показателей и наблюдалось в различных звеньях эпилептогенеза, что свидетельствует о важной роли аутоиммунных процессов в становлении эпилепсии. Имеются все основания считать, что пусковым механизмом формирования эпилептогенного очага могут быть различные иммунопатологические процессы. В рассматриваемых группах больных с ДСЭ наблюдалось угнетение гуморального и клеточного звеньев иммунитета. Характерным являлся нарастающий дисбаланс систем иммунореактивности – от компенсированной до декомпенсированной иммунной недостаточности смешанного типа. Иммунный профиль Т-лимфоцитов периферической крови пациентов с ДСЭ проявлялся изменением экспрессии CD3+, CD4+ и CD8+. Такой фенотип наиболее часто определялся в продвинутых стадиях доклинического периода эпилепсии и выражался низкой экспрессией CD3+ и СD4+-лимфоцитов при нарастающем и декомпенсированном эпилептогенезе. Выявленный дисбаланс подтверждался низким иммунорегуляторньм индексом. Гуморальный иммунитет характеризовался снижением концентрации иммуноглобулинов А и М и, напротив, увеличением IgE. Обнаружено усиление экспрессии CD25+, которое наблюдалось на фоне снижения содержания CD22+ и, наоборот, увеличения – СD20+-клеток. Увеличение популяции лимфоцитов, несущих -цепи рецепторов к ИЛ-2 (CD25+), указывает на существование источника эндогенной активации клеток. Представленные изменения отражают процесс поликлональной ингибиции антителопродуцирующих клеток организма. Обнаруженный дисбаланс поддерживался избыточным выделением потенциально нейротоксичных медиаторов. Так, у больных с ДСЭ отмечались высокие концентрации провоспалительных цитокинов в крови (ФНО-, ИЛ-1 и ИЛ-2), являющихся причиной многих локальных и системных изменений, и что, как показали наши исследования, было отчетливо связано с состоянием эпилептогенеза. Особое внимание следует обратить на ИЛ-2 и ФНО-, уровень которых существенно повысился в фазе декомпенсированного эпилептогенеза. Эти цитокины способны стимулировать пролиферацию астроцитов и олигодендроцитов, изменять биоэлектическую активность ядер гипоталамуса, влиять на судорожную активность коры головного мозга. Вероятно, уровень цитокинов в определенной степени коррелирует с выраженностью нейроаутоиммунного процесса в центральной нервной системе, что способствует поддержанию возникших локальных изменений и их прогрессированию. Можно сделать предположение о том, что эти цитокины являются маркерами поражения мозга при эпилепсии и предикторами судорожной готовности. Как известно, антитела к нейротрофическим факторам, образующиеся при различных формах неврологических расстройств, усугубляют нарушение трофики нейрона, что затрудняет процесс восстановления обратимо поврежденных нейрональных клеток. Антитела, реагирующие с нейрональными структурами очага, обуславливают усиление тяжести деструктивных поражений, что, в свою очередь, увеличивает тяжесть нейроиммунного процесса. Существенный интерес представляют также результаты изучения ЦИК при эпилепсии. Установлено, что ЦИК вмешиваются в ход иммунных реакций, активируя или блокируя В-лимфоциты, подавляя активность антителопродуцирующих клеток, стимулируя выработку супрасенсорных и хелперных факторов Т-лимфоцитов, влияя на клеточную цитотоксичность. В наших исследованиях обнаружено повышение содержания ЦИК в сыворотке крови у больных с ДСЭ, а самый высокий уровень ЦИК отмечался при нарастающем и декомпенсированном эпилептогенезе. При недостаточной элиминации фагоцитами ЦИК могут откладываться на базальной мембране и, повреждая эндотелий мелких сосудов головного мозга, вызывать нарушение целостности гематоэнцефалического барьера, иммунные, водно-электролитные, медиаторные изменения, которые способствуют прогрессированию и манифестации эпилепсии. В последние годы получены данные, согласно которым изменения энергетических процессов в нейронах эпилептического очага носят многокомпонентный характер, одним из проявлений которых является “оксидантный стресс”. Последний представляет собой избыточное накопление интермедиантов кислорода и других свободнорадикальных элементов, которые оказывают токсическое воздействие на нервную ткань и “запускают” целый ряд патохимических процессов. В частности оксидантный стресс ведет к избыточному образованию продуктов перекисного окисления липидов и ионов NH4+, которые вызывают или усиливают процессы деполяризации мембраны. Между тем тиоловые соединения являются составной частью антиоксидантной системы и их повышение, на наш взгляд, на первых порах может носить компенсаторный характер, как проявление защитной неспецифической реакции организма в ответ на действие целого ряда неблагоприятных факторов. В то же время, хорошо известно, что распад белков осуществляется тиоловьми ферментами – катепсинами, которые активируются низкомолекулярными соединениями, содержащими SH-группы. Активность внутриклеточных протеолитических ферментов, расщепляющих эндогенные и экзогенные белки, во время эпилептического приступа возрастает. Этому способствует увеличение концентрации SH-групп белков и низкомолекулярных соединений. Среднемолекулярные пептиды, которые являются маркерами эндогенной интоксикации и имеют иммуносупрессивные свойства, оказывают негативное влияние на иммунологическую резистентность организма и поддерживают формирование эпилептической активности в головном мозге. Ослабление, а затем срыв антиоксидантной защиты и прогрессирующее нарушение пептидного обмена на уровне среднемолекулярных олигопептидов сопровождается ограничением компенсаторных возможностей эпилептогенеза.

Таким образом, эпилепсия является заболеванием, в основе которого лежит дезинтеграция нейроиммунных взаимодействий, что проявляется развитием иммунодефицита смешанного типа. Именно нейроаутоиммунный процесс является одним из наиболее важных звеньев патогенеза эпилепсии, особенно в дебюте заболевания, на стадии ее доклинического течения. Не вызывает сомнений тот факт, что при возникновении эпилепсии имеет место доклиническая стадия, т.е. обнаруживается фаза процесса, когда макро- и микроструктурным функциональным изменениям в тканях мозга предшествуют иммунопатологические сдвиги и метаболические расстройства, протекающие на молекулярном и субклеточных уровнях, клинически никак не проявляющиеся и не имеющие некоторых патофизиологических феноменов. В связи с этим определение указанных показателей может быть рекомендовано в качестве дополнительных критериев диагностики ДСЭ и мониторинга больных, а после диагностирования у больного доклинической стадии эпилепсии оценка иммунного статуса важна для составления адекватной программы лечения. Именно в этот бессимптомный период развивающейся эпилепсии необходима адекватная и эффективная терапия, а не позже, когда лечение проводится с целью облегчения страдания больного от эпилептических припадков. К настоящему времени уже известен ряд лекарственных препаратов, которые оказывают корригирующее воздействие на иммунный гомеостаз (иммуноглобулины, кортексин, циклоферон и некоторые др.), блокируют основные пути формирования оксидантного стресса (аллопуринол, альфа-токоферол, N-ацетилцистеин и никотинамид) и при этом обладают антиэпилептическим эффектом. Лечение пациентов с ДСЭ должно быть направлено на единую функциональную систему, включающую все ее составляющие – нейроаутоиммунную, нейрофизиологическую, нейрохимическую, биохимическую, по-иному работающих при данной патологии.

Предложенный способ диагностики доклинической стадии эпилепсии был апробирован в Санкт-Петербургском научно-исследовательском психоневрологическом институте им. В.М.Бехтерева.

Полученные исследования сведетельствуют о несомненном значении антиоксидальной системы (АС) и пептидного обмена в патогенезе эпилепсии. Ослабление, а затем срыв антиоксидальной защиты и прогрессирующее нарушение пептидного обмена на уровне среднемолекулярных олигопептидов сопровождается ограничением компенсаторных возможностей эпилептогенеза. Определение указанных показателей может быть рекомендовано в качестве дополнительных критериев диагностики доклинической стадии эпилепсии и мониторинга больных.

Формула изобретения

Способ диагностики доклинической стадии эпилепсии, включающий электроэнцефалографический мониторинг с подсчетом фрактальной размерности флуктуации спектральной мощности и биохимическое тестирование пароксизмальной активности головного мозга с помощью тест-системы, позволяющей определить уровень в крови аутоантител к глутаматсвязывающему мембранному белку головного мозга, отличающийся тем, что дополнительно проводят оценку иммунного гомеостаза, уровня общих тиоловых групп белков (SH-групп) в сыворотке крови калориметрическим методом, основанным на взаимодействии молекулярного йода со свободными сульфгидрильными группами белков, и спектрофотометрически оценивают содержание среднемолекулярных олигопептидов (СМП), причем значения SH-групп, равные 2,87-3,42 ммоль/л, и значения СМП, равные 2,89-3,38 г/л, подтверждают наличие у больного доклинической стадии эпилепсии.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 13.02.2005

Извещение опубликовано: 27.01.2007 БИ: 03/2007