Патент на изобретение №2246116

(54) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКОГО И НЕАЛЛЕРГИЧЕСКОГО РИНИТОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к аллергологии и оториноларингологии. Способ дифференциальной диагностики аллергического и неаллергического ринитов включает получение назального секрета и определение в нем свободного гемоглобина. Назальный секрет получают путем механического раздражения слизистой оболочки полости носа размещением в каждую из ее половин на 15 минут шарика из пучка шерстеподобного полиакрилонитрильного волокна с последующим переносом этих шариков в 2,7% раствор этилендиаминотетрауксусного натрия. После выжимания и удаления шариков раствор центрифугируют для отделения эритроцитов. В полученной надосадочной жидкости иммунометрически определяют концентрацию свободного гемоглобина и при значениях показателей концентрации 12 мкг/мл и выше устанавливают диагноз – аллергический ринит. Способ обеспечивает высокую специфичность и точность диагностики. 2 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к аллергологии и оториноларингологии, и предназначено для дифференциальной диагностики аллергического и неаллергического (например, инфекционного, гипертрофического, вазомоторного) ринитов.

От корректности патогенетического диагноза зависит адекватность и успешность лечения, но при часто встречающейся нетипичной клинической картине дифференцировать аллергический и неаллергический риниты у атопических и неатопических больных весьма затруднительно. При рините любого патогенеза в носовых выделениях обнаруживаются как целые эритроциты, так и свободный гемоглобин в различных пропорциях [1, 2, 3, 4]. Эритроциты происходят из крови, излившейся на поверхность эпителия в результате макро- и микрогеморрагий, и эвакуируются из полости носа вместе с назальным секретом. Они постепенно лизируются и высвобождают гемоглобин лишь в том случае, если находятся в сгустке крови, надолго прилипшем к слизистой оболочке [4]. Основной же механизм появления свободного гемоглобина в назальном секрете – это экссудация и трансэпителиальный перенос его из плазмы крови или из субэпителиальных кровоизлияний вследствие повышенной проницаемости сосудов, нарастания отечности и рыхлости слизистой [5, 6]. Именно этот механизм действует при аллергическом воспалении, когда свободный гемоглобин накапливается в назальном секрете под влиянием гистамина, брадикинина, хемокинов и иммунных комплексов на эндотелий капилляров, и может служить патогенетическим маркером атопии. Однако первые попытки дифференциальной диагностики аллергического и неаллергического ринитов путем определения концентрации свободного гемоглобина в назальном секрете [5, 6] оказались безуспешными из-за концептуальных и технических недостатков.

В качестве ближайшего аналога можно рассматривать известный способ дифференциальной диагностики аллергического и неаллергического ринита [5], который включает орошение полости носа вначале изотоническим (0,9%), а затем гипертоническим (21,6%) раствором хлористого натрия и сбор носового смыва после воздействия гипертонического раствора, гомогенизацию смыва замораживанием – оттаиванием и определение концентрации свободного гемоглобина по способности катализировать окисление 3,3’, 5,5’ тетраметилбензидина перекисью водорода (окрашивание продуктов окисления пропорционально концентрации гемоглобина) [7, 8].

Осуществление известного способа диагностики выявило в назальном секрете при аллергическом рините меньше (7,3±0,7 мкг/мл) свободного гемоглобина, чем при неаллергическом (9,5±1,8 мкг/мл), и только среди больных с концентрацией свободного гемоглобина выше 16,5 мкг/мл при аллергическом патогенезе заболевания было больше этого маркера (43,5±3,5 мкг/мл) по сравнению с неаллергическим (39,3±5,8 мкг/мл). Однако при этом среди всех больных ринитом известный способ диагностики выявлял в назальном секрете больше 16,5 мкг/мл свободного гемоглобина только в 12% случаев. Следовательно, диагностическая ценность известного способа дифференциальной диагностики аллергического ринита от неаллергического по концентрации свободного гемоглобина в назальном секрете весьма ограничена.

Несовершенство известного способа обусловлено следующим:

– присутствие в назальном секрете свободного гемоглобина и гемоглобина, содержащегося в эритроцитах, никак не дифференцируется, хотя соотношение этих двух форм гемоглобина при аллергическом и неаллергическом ринитах различно;

– промывание полости носа изотоническим раствором хлористого натрия перед провокацией секреции удаляет свободный гемоглобин, накопившийся до момента обследования;

– провокация назальной секреции гипертоническим раствором хлористого натрия вызывает агрегацию липопротеинов и альфа-глобулинов на поверхности эпителия, а также уплотнение межклеточного матрикса, что не способствует, как выяснилось [5], дополнительному высвобождению гемоглобина;

– замораживание и последующее оттаивание промывной жидкости приводит к лизису уцелевших эритроцитов и сглаживает принципиальное различие между образцами, исходно содержащими свободный гемоглобин и целые эритроциты в различных соотношениях;

– бензидиновый метод определения гемоглобина дает много ложноположительных и ложноотрицательных оценок: завышает концентрацию маркера из-за присутствия в назальном секрете миелопероксидаз гранулоцитарного происхождения и бактериальных пероксидаз при инфекционном рините или занижает ее в силу присутствия эндогенного антиоксиданта – мочевой кислоты или поступающей с пищей аскорбиновой кислоты.

В данном изобретении с целью повышения диагностической эффективности и надежности способа слизистую носовой полости обследуемого индивида вместо предварительного промывания и орошения гипертоническим раствором хлористого натрия подвергают неинвазивному, дозированному по времени механическому раздражению, помещая в каждую из ее половин скатанный в шарик пучок шерстеподобного полиакрилонитрильного волокна, например “нитрон” [9], который вызывает секрецию носовых выделений, впитывает их и адсорбирует свободный гемоглобин.

Затем волокно с поглощенным секретом переносят в раствор этилендиаминотетрауксусного натрия, в котором происходит элюирование свободного гемоглобина, и отделяют целые эритроциты и иные частицы центрифугированием. В надосадочной жидкости определяют содержание гемоглобина стандартным иммунометрическим методом, например, с помощью тест-набора “Сангвидет” в реакции коагглютинации взвеси фиксированных формальдегидом клеток Staphylococcus aureus Cowan I, нагруженных через белок А аффинноочищенными кроличьими антителами к гемоглобину человека [10].

Вначале путем истощения взвесью фиксированных формальдегидом клеток Staphylococcus aureus Cowan I, нагруженных ферромагнитными частицами, из надосадочной жидкости удаляют все компоненты, способные связываться со стафилококком (антитела, муцин, трансферрин, гаптоглобин и т.п.), осаждая кокки магнитом. Затем из надосадочной жидкости готовят серию двукратных разведений и вносят в них взвесь стафилококков, нагруженных антителами к гемоглобину.

После инкубации определяют конечное разведение надосадочной жидкости, в котором наблюдается четкая агглютинация стафилококка, сопоставимая с агглютинацией, вызываемой стандартным раствором гемоглобина человека. Учитывая разведение надосадочной жидкости, рассчитывают концентрацию гемоглобина в исходном образце назального секрета.

При осуществлении способа согласно изобретению пучки полиакрилонитрильного волокна, например нитрона, скатывают в шарики массой 120±10 мг и погружают на сутки в 1% раствор додецилсульфата натрия, отмывают очищенной водой и для высушивания и стерилизации на 2 часа помещают в сухожаровой шкаф при температуре (100±5)°С.

Носовым пинцетом в средний носовой ход каждой половины полости носа помещают по шарику полиакрилонитрильного волокна на 15 мин. Затем волокно извлекают, помещают в мерную центрифужную пробирку и заполняют ее до отметки 2 мл 2,7% раствором этилендиаминотетрауксусного натрия (рН 7,4). Пинцетом выжимают волокно в этом растворе и извлекают из пробирки. Раствор центрифугируют при 100 g в течение 20 мин для осаждения целых эритроцитов, лейкоцитов, слизи и корок.

100 мкл надосадочной жидкости переносят в лунку “Н” 1-го ряда полистироловой панели для микротитрования, затем туда же – 100 мкл ферромагнитного сорбента из тест-набора для иммунометрического определения скрытой крови “Сангвидет”, перемешивают на встряхивателе в течение 1 мин и осаждают частицы сорбента магнитом.

Разбавив в 10 раз водой очищенной 0,1 М натрий-фосфатный буфер (рН 7,3±0,1) с 1,5 М хлористым натрием из тест-набора, готовят забуференный физиологический раствор (ЗФР) и вносят его по 50 мкл в лунки “G, F, Е, D, С, В и А” 1-го ряда, во все лунки 2-го ряда и в лунку “Н” 3-го ряда.

Во флакон, содержащий 0,2 мг лиофилизированного кристаллического гемоглобина человека из тест-набора вносят 4 мл ЗФР, растворяют и раскапывают по 50 мкл в лунки “Н” 2-го и 4-го рядов. После этого в 1-м и 2-м рядах готовят серии двукратных разведений, перенося по 50 мкл содержимого из лунки “Н” в лунку “G”, из “G” в “F” и так до конца ряда. Каждый раз после переноса содержимое перемешивают с ЗФР, из лунок “А” 50 мкл смеси выбрасывают.

Затем во флакон “диагностикума” из тест-набора (лиофилизированной взвеси стафилококка, нагруженного антителами к гемоглобину) вносят 1,5 мл ЗФР и, встряхнув для получения однородной взвеси, раскапывают ее по 50 мкл в лунки “G, F, Е, D, С, В и А” 1-го, во все лунки 2-го и в лунку “Н” 3-го ряда.

В имеющийся в тест-наборе флакон со “стафилококковым реагентом” (лиофилизированной взвесью фиксированного стафилококка, не нагруженного антителами) вносят 1,5 мл ЗФР и, встряхиванием получив однородную взвесь, закапывают 50 мкл ее в лунку “Н” 4-го ряда.

Панель на 1 мин помещают на встряхиватель, затем на 2 ч в термостат при (37±1)°С и на 2-18 ч в холодильник при (6±2)°С. Коагглютинацию стафилококка учитывают визуально по форме осадка и рисунку краев агглютината.

При отсутствии коагглютинации (компактный осадок кокков с ровным краем) в лунках “Н” в 3-м и 4-м рядах (в отрицательных контролях) определяют те последние лунки 1-го и 2-го рядов (точнее, те наибольшие разведения надосадочной жидкости назального секрета и референтного раствора гемоглобина), в которых еще наблюдается отчетливая коагглютинация диагностикума.

При расчете разведения назального секрета учитывают, что в лунке “Н” он разбавляется магнитным сорбентом 1:2. Чтобы определить знаменатель разведения в той последней лунке 1-го ряда, где произошла коагглютинация, нужно 2 возвести в степень, равную ее номеру в ряду – (N₁ – номер лунки 1 ряда: “Н” – 1, “G” – 2, “F” – 3 и т.д.).

Растворение референс-образца гемоглобина дает раствор, 50 мкл которого содержат 2,5 мкг гемоглобина. После внесения этих 50 мкл в лунку “Н” 2-го ряда, где уже содержится 50 мкл ЗФР, переноса 50 мкл в лунку “G” и добавления 50 мкл “диагностикума” концентрация гемоглобина в лунке “Н” будет равна 1,25 мкг в 100 мкл или 12,5 мкг/мл.

Чтобы определить концентрацию референс-образца гемоглобина в той последней лунке, где произошла коагглютинация, 25 мкг/мл делят на знаменатель разведения, т.е. на (N₂ – номер лунки 2-го ряда: “Н” – 1, “G” – 2 и т.д.).

Расчет исходной концентрации свободного гемоглобина в назальном секрете основан на общепринятом предположении, что гемоглобин, содержащийся в разведениях референс-образца и назального секрета, вызывает коагглютинацию “диагностикума” в равной концентрации. Чтобы ее вычислить, умножают величину концентрации гемоглобина в учетной лунке 2-го ряда на знаменатель разведения назального секрета. Полученная величина представляет собой концентрацию свободного гемоглобина в назальном секрете (точнее, в стандартном объеме смыва с волокна) в мкг/мл (X):

Процедура получения назального секрета и иммунометрическое определение свободного гемоглобина, использованные в настоящем изобретении, позволили преодолеть недостатки известного способа дифференциальной диагностики аллергического и неаллергического ринитов. Эффективность предлагаемого способа продемонстрирована при обследовании 154 пациентов с клинически и лабораторно подтвержденными диагнозами. В 85 случаях был диагностирован аллергический персистирующий или интермиттирующий ринит с выявлением в 70 случаях этиологически значимых аллергенов и сопутствующей атонической патологии (бронхиальная астма, атопический дерматит). У 69 пациентов ринит патогенетически не был связан с атопией (инфекционный, гипертрофический, атрофический, вазомоторный риниты, нагноение в околоносовых пазухах, носоглотке, фурункул преддверия носа, посттравматическое воспаление и рецидивирующее носовое кровотечение). Результаты определения предлагаемым методом концентрации свободного гемоглобина в носовом секрете у пациентов двух групп и 36 здоровых лиц представлены в таблице 1.

Концентрация свободного гемоглобина в назальном секрете ниже 6 мкг/мл была у 99% практически здоровых лиц и только у 12% пациентов с аллергическим ринитом и в 51% случаев при отоларингологической патологии неаллергического генеза.

Концентрация 12 мкг/мл и выше не встречалась у практически здоровых и была выбрана как дифференциально-диагностический критерий.

Согласно изобретению концентрация свободного гемоглобина в надосадочной жидкости, полученной из назального секрета 12 мкг/мл и выше, может служить просто выявляемым симптомом аллергического ринита. Данные для оценки диагностической эффективности предлагаемого способа приведены в таблице 2.

Чувствительность способа – способность выявлять аллергический генез ринита среди больных именно с этой патологией:

а:(а+с)·100=57:(57+28)·100=67%.

Специфичность (избирательность) способа – способность идентифицировать риниты неаллергического генеза:

d:(b+d)·100=57:(12+57)·100=83%.

Вероятность правильного диагноза у больных с аллергическим ринитом:

а:(а+b)·100=57:(57+12)·100=83%.

Эти характеристики предлагаемого способа диагностики аллергического ринита свидетельствуют о достижении цели изобретения, так как более сложный и трудоемкий способ выявления аллергенспецифических IgE имел почти такую же специфичность и вероятность – 86% при несколько большей чувствительности – 82%.

Пример 1. Больная К. 26 лет.

В течение нескольких лет страдает хроническим ринитом, который обостряется вне зависимости от сезона и времени суток. Клинически заболевание проявляется заложенностью носа, прозрачными выделениями из носа, чиханием, сопровождается головными болями.

Проведена диагностика заявленным способом. Результат теста показал концентрацию свободного гемоглобина в надосадочной жидкости, полученной из назального секрета, равную 6,3 или 3,1 мкг/мл.

Установлен диагноз: ринит неаллергического генеза. При длительном обследовании выявлен вазомоторный ринит. Назначено соответствующее лечение.

Пример 2. Больной М. 17 лет.

Страдает выраженными проявлениями ринита в весенне-летнее время. Проведена диагностика заявленным способом. Концентрация свободного гемоглобина составила 25 мкг/мл.

Заключение: аллергический ринит. Рекомендовано обследование по выявлению причинных аллергенов, в частности, для выявления поллиноза.

Таким образом, предлагаемый способ дифференциальной диагностики ринитов является специфичным и повышает точность диагностики при ее упрощении. Рекомендован для широкого использования в клинической практике.

Список литературы

Формула изобретения

Способ дифференциальной диагностики аллергического и неаллергического ринитов, включающий получение назального секрета и определение в нем свободного гемоглобина, отличающийся тем, что получают назальный секрет путем механического раздражения слизистой оболочки полости носа размещением в каждую из ее половин на 15 мин шарика из пучка шерстеподобного полиакрилонитрильного волокна с последующим переносом этих шариков в 2,7% раствор этилендиаминотетрауксусного натрия, после выжимания и удаления шариков раствор центрифугируют для отделения эритроцитов, в полученной надосадочной жидкости иммунометрически определяют концентрацию свободного гемоглобина и при значениях показателей концентрации 12 мкг/мл и выше устанавливают диагноз – аллергический ринит.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 28.01.2006

Извещение опубликовано: 27.12.2006 БИ: 36/2006

NF4A Восстановление действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

Дата, с которой действие патента восстановлено: 27.11.2007

Извещение опубликовано: 27.11.2007 БИ: 33/2007