Патент на изобретение №2246112
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ БИОХИМИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ АКТИВНОСТИ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕПАТИТА
(57) Реферат:
Изобретение относится к области медицины, а именно биохимии, и может быть использовано для определения степени активности хронического гепатита. В сыворотке крови определяют уровень лактоферрина и желчных кислот. При их отношении, равном 5-17, определяют хронический гепатит высокой активности. Способ позволяет повысить точность определения степени активности хронического гепатита.
Изобретение относится к области медицины, а именно биохимии, и может быть использовано, в частности, для определения степени активности хронического гепатита. В практической медицине известны способы определения активности хронического гепатита, основанные на общеклинических данных (Григорьев П.Я., Яковенко Э.П. Диагностика и лечение болезней органов пищеварения. – М.: Медицина, 1996. – 515 с.; Шерлок Ш., Дули Дж. Заболевания печени и желчных путей. – М.: ГЭОТАР, 1999. – 859 с.). Недостатками этих способов являются: высокая степень субъективности; недостаточно хорошая воспроизводимость. Данный способ имеет следующие недостатки: способ не является достаточно точным, так как имеет достаточно широкую “серую зону”, в пределах которой достоверность интерпретации уровня сывороточных желчных кислот для определения степени активности хронического гепатита низкая. Целью представленного изобретения является повышение точности определения степени активности хронического гепатита. Поставленная цель в изобретении достигается тем, что в сыворотке крови определяют уровень лактоферрина и желчных кислот и при их отношении, равном 5-17, определяют хронический гепатит высокой активности. Изолированное определение желчных кислот сыворотки крови в ряде случаев не позволяет однозначно диагностировать хронический гепатит высокой степени активности, так как высокий уровень желчных кислот характерен и для цирроза печени (Григорьев П.Я., Яковенко Э.П., 1996). Определение только лактоферрина в данном случае также не является информативным, так как снижение уровня этого белка наблюдается при целом ряде патологических состояний (Николаев А.А., 1994). Одновременное определение в сыворотке крови уровня лактоферрина и уровня желчных кислот с последующим определением соотношения между ними позволяет значительно повысить эффективность способа определения хронического гепатита высокой степени активности. Таким образом, преимущество предлагаемого способа в более высокой диагностической точности при определении хронического гепатита высокой степени активности. Положительный эффект предлагаемого способа достигается точностью оценки сывороточного уровня лактоферрина и желчных кислот. Предложенный способ был успешно апробирован в I Александро-Мариинской Областной клинической больнице с января 2001 года по январь 2003 года на 128 пациентах с хроническими диффузными заболеваниями печени. Ниже приводятся результаты апробации. Пример 1. Больной И-в Т. М., 39 лет (история болезни № 15947), находился в клинике с 3.10.2002 по 29.10.2002 г. Поступил со следующими жалобами: тупые боли в правом подреберье, плохой аппетит, снижение массы тела, слабость, кожный зуд. Объективно: состояние удовлетворительное, кожные покровы с желтушным оттенком, склеры субиктеричны, телеангиэктазии на лице, шее, груди, пальмарная эритема. Легкие и сердце без особенностей. Живот мягкий, слегка болезненный в правом подреберье. Размеры печени по Курлову: 13-11-8 см, при пальпации край мягкий, закруглен. Селезенка пальпаторно и перкуторно не увеличена. Для определения уровня желчных кислот сыворотки крови был использован энзиматический метод. В основе метода лежит ферментативная реакция окисления 3-альфа-гидрокси группы желчных кислот в оксо группу под действием фермента 3-альфа-гидроксистероиддегидрогеназы и дальнейший перенос атома водорода с помощью фермента диафоразы и НАД на нитросиний-тетразолий с образованием окрашенных продуктов. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации желчных кислот в сыворотке крови. Схема проведения реакции такова: 1) Пробы 20 мкл сыворотки крови или стандартного раствора желчных кислот помещают в пробирки. 2) Добавление Реагента А из набора 0,5 мл. 3) Экспозиция при 37°С 5 минут. 4) Добавление Реагента Б из набора 0,5 мл. 5) Экспозиция при 37°С 15 минут. 6) Добавление стоп-реагента 0,2 мл. 7) Колориметрия при 530 нм. Параллельно с анализом проб проводили исследование стандартных разведений желчных кислот для построения калибровочных кривых. Уровень желчных кислот сыворотки крови составил 113,2 мкмоль/л. Уровень лактоферрина сыворотки крови определяли методом иммуноферментного анализа. В настоящей работе нами использовался твердофазный иммуноферментный анализ, когда на нерастворимый носитель сорбируется белок (антиген или антитело) и далее все иммунохимические взаимодействия происходят на этом носителе. В качестве твердой фазы мы применяли 96-луночные плашки фирмы “Linbro”. В лунки вносили 200 мкл специфических антител (2-5 мкг), инкубировали в течение 16-20 часов и отмывали, используя забуференный физиологический раствор (рН 7,2), содержащий 0,05% твина-20. После промывки в лунки вносили по 200 мкл последовательных разведений стандартного антигена, обычно содержащие от 0,1 до 200 нг/мл белка, исследуемые образцы и отмывающий раствор (контроль). После инкубации и промывки вносили 200 мкл антител к исследуемому антигену, ковалентно связанных с ферментом (конъюгат) в разведении, которое устанавливалось эмпирически. После инкубации и промывки проводили ферментативную реакцию и спектрофотометрию. Калибровочный график строили в каждом опыте. Чувствительность метода в нашей работе составила 6 нг/мл. Конъюгацию антител с ферментом проводили перийодатным окислением. Растворяли 5 мг пероксидазы-6 (“Sigma”) в 1 мл дистиллированной воды, прибавляли 2 мл свежеприготовленного 0,1 М раствора перийодата натрия и перемешивали в течение 30-40 минут при комнатной температуре. Альдегидный раствор пероксидазы диализовали против 10 мл карбонатного буфера (рН 9,5) и добавляли 10 мг специфических антител, растворенных в том же буфере, после чего перемешивали при комнатной температуре 2-3 часа. В полученную смесь добавляли 0,1 мл 0,4% раствора боргидрида натрия и оставляли на 2 часа при комнатной температуре. Для стабилизации к конъюгату добавляли бычий сывороточный альбумин до 1%, глицерин до 40% и хранили при -20°С до использования. Сывороточный уровень лактоферрина составил 917,2 нг/мл. Соотношение рассчитывали по формуле: уровень лактоферрина (нг/мл)/уровень желчных кислот (мкмоль/мл). Соотношение составило 917,2/113,2=8,1. Так как 8,1 входит в диапазон 5-17, то больному поставлен диагноз: хронический гепатит высокой степени активности. Проведенное в дальнейшем клинико-инструментальное исследование, включавшее рентгенологические, ультразвуковые и др. методы исследования, позволило полностью верифицировать поставленный диагноз. Пример 2. Больной М-в В. В., 22 лет (история болезни №7539), находился в клинике с 8.02.2002 по 27.02.2002 г. Поступил с жалобами на периодические ноющие боли в правом подреберье. Больным себя считает с 1999 г., когда перенес острый вирусный гепатит “В”. Объективно: состояние удовлетворительное, кожные покровы обычной окраски. Легкие и сердце без особенностей. Живот мягкий, при пальпации умеренно болезненный в правом подреберье и эпигастральной области. Размеры печени по Курлову: 9-8-7 см, при пальпации край мягкий, закруглен. Селезенка пальпаторно и перкуторно не увеличена. В вирусном маркерном спектре: HbsAg (+), HbeAg (-), aHCV (+), aHDV (-). Уровень желчных кислот сыворотки крови, определенный по описанному выше методу (см. пример 1), составил 37,7 мкмоль/мл, а уровень лактоферрина, определенный иммуноферментным методом (см. пример 1), составил 1690,0 нг/мл. Соотношение составило 1690,0/37,7=44,8. Так как 44,8 не входит в диапазон 5-17, то больному при постановке диагноза высокая степень активности была исключена. Диагноз: хронический гепатит сочетанной вирусной этиологии (В+С), минимальной степени активности. Проведенное в дальнейшем клинико-инструментальное исследование, включавшее рентгенологические, ультразвуковые и др. методы исследования, позволило полностью верифицировать поставленный диагноз. Пример 3. Больная Ш-а О. Д., 52 лет (история болезни № 13471), находилась в клинике с 21.08.2001 по 22.09.2001 г. Жалобы: тупые боли в правом подреберье, кожный зуд, слабость, утомляемость, сонливость в дневные часы, увеличение живота в объеме, тошнота, сухость во рту, десневые, носовые кровотечения, геморраггии на коже, судороги в конечностях, артралгии, дрожание рук, головы, отечность ног, малое количество мочи. Объективно: состояние тяжелое, заторможена, кожные покровы желтушной окраски, со следами расчесов, телеангиэктазии на теле, геморрагии на конечностях, теле, склеры субиктеричны, “печеночный” язык, пальмарная эритема. Отеки нижних конечностей. Легкие и сердце без особенностей. Живот увеличен в объеме за счет свободной жидкости в брюшной полости, болезненный при пальпации в правом подреберье. Размеры печени по Курлову: 10-7-7 см, при пальпации край плотный, неровный. Пальпируется нижний полюс селезенки на вдохе. Уровень желчных кислот сыворотки крови, определенный по описанному выше методу (см. пример 1), составил 98,3 мкмоль/л. Уровень лактоферрина, определенный иммуноферментным методом (см. пример 1) составил 302,1 нг/мл. Соотношение составило 302,1/98,3=3,07. Так как 3,07 не входит в диапазон 5-17, то больному при постановке диагноза гепатит высокой степени активности был исключен. Диагноз: цирроз печени. Проведенное в дальнейшем клинико-инструментальное исследование, включавшее рентгенологические, ультразвуковые и др. методы исследования, позволило полностью верифицировать поставленный диагноз. Предлагаемым способом достигается положительный эффект: повышается точность определения степени активности хронического гепатита. Это позволяет своевременно назначить адекватное лечение, что повышает его эффективность, а значит, улучшает прогноз для больного. Предлагаемый способ может быть использован в клинической практике для определения степени активности хронического гепатита.
Формула изобретения
Способ биохимического определения степени активности хронического гепатита путем оценки уровня желчных кислот сыворотки крови, отличающийся тем, что в сыворотке крови определяют уровень лактоферрина и желчных кислот и при их соотношении, равном 5-17, определяют хронический гепатит высокой активности.
MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 12.03.2005
Извещение опубликовано: 27.12.2006 БИ: 36/2006
|
||||||||||||||||||||||||||
