Патент на изобретение №2244743

(54) БАКТЕРИАЛЬНЫЙ ПРЕПАРАТ, СПОСОБ ЕГО ПРОИЗВОДСТВА, ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ КЛЕТОК ESCHERICHIA COLI BKM CR-322D И СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ И ДОМАШНИХ ЖИВОТНЫХ И ПТИЦ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии, в ветеринарии. Для приготовления препарата клетки Escherichia coli BKM CR-322D выращивают на питательной среде, содержащей бульон Хоттингера, глюкозу, дрожжевой экстракт, сульфат марганца, гидрофосфат калия, хлорид натрия и воду водопроводную, при содержании аминного азота 125-155 мг %. Причем глюкозу вносят дробно в процессе выращивания клеток, который ведут при температуре 30-31°С при перемешивании и аэрации в течение 10-12 ч. Полученную культуральную жидкость, содержащую не менее 3·10⁹ бак.тел/мл, смешивают с защитной сахарозожелатиновой средой и подвергают лиофильной сушке. Высушенную массу хранят под азотом, что повышает сохранность жизнеспособных клеток в препарате. Использование препарата для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственных и домашних животных и птиц показало его эффективность. 4 с. и 13 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение в ветеринарии.

Изобретение может быть использовано для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственных и домашних животных и птиц. В большинстве случаев эти болезни являются инфекционными и вызываются энтеробактериями разных видов и некоторыми видами вирусов. Часто эти заболевания протекают в виде смешанных вирусно-бактериальных инфекций. Тяжелыми желудочно-кишечными заболеваниями являются также дисбактериозы.

Известен способ производства бактериального препарата для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний (в частности – колибактериоза) сельскохозяйственных животных, включающий выращивание клеток Escherichia coli BKM CR-322D при рН 7,0-7,5 на питательной среде, содержащей бульон Хоттингера, глюкозу, минеральные соли и воду, с получением бактериальных клеток, последующее смешивание полученных клеток с сахарозожелатиновой средой и лиофильную сушку приготовленной смеси (Патент СССР №1819428, C 12 N 15/30,1990) [1] – прототип способа по п.1.

Однако данным известным способом получают небольшую биомассу клеток, а приготовленный из них препарат в процессе хранения теряет свою биологическую активность.

Известна питательная среда для выращивания клеток E.coli BKM CR-322D, содержащая бульон Хоттингера, глюкозу, MgSО₄, соль фосфорной кислоты и воду [1] – прототип питательной среды.

Однако выход клеток при их выращивании на данной известной среде невысокий.

Известен бактериальный препарат, содержащий лиофильно высушенную смесь клеток E.coli BKM CR-322D и сахарозожелатиновой среды [1] – прототип бактериального препарата.

Однако сохранность жизнеспособных клеток при хранении данного известного препарата невысокая.

Известен способ профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний животных, включающий назначение им перорального приема клеток Escherichia coli BKM CR-322D [1] – прототип способа по п.10.

Однако данный известный способ апробирован только на телятах, а назначаемые дозы бактериального препарата, необходимые для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний у других животных и птиц, не указаны.

Техническим результатом, достигаемым при реализации настоящей группы изобретений, является повышение выхода клеток E.coli BKM CR-322D при их выращивании, повышение сохранности жизнеспособных клеток при хранении приготовленного из них бактериального препарата, расширение возможностей бактериального препарата для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний у сельскохозяйственных и домашних животных и птиц.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения бактериального препарата для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственных и домашних животных и птиц, предусматривающем выращивание клеток Escherichia coli CR-322D на питательной среде, содержащей бульон Хоттинтера, глюкозу, сульфат марганца, соль фосфорной кислоты, воду при рН 7,0-7,5, смешивание полученной биомассы с сахарозожелатиновой средой и лиофильную сушку, отличительной особенностью является то, что в состав питательной среды дополнительно вводят дрожжевой экстракт, хлорид натрия, в качестве соли фосфорной кислоты она содержит гидрофосфат калия, в качестве воды – воду водопроводную, глюкозу вводят дробно в процессе выращивания клеток, который ведут при температуре 30-31°С и сопровождают его стабилизацией уровня рН, постоянным перемешиванием и аэрацией, завершают процесс через 10-12 час, а лиофильной сушке подвергают смесь полученной культуральной жидкости с сахарозожелатиновой средой в соотношении 3:1.

Предпочтительно используют сахарозожелатиновую среду, содержащую сахарозу, желатин и воду дистиллированную при их следующем соотношении, мас.%:

сахароза 39-41

желатин 5-6

вода дистиллированная остальное

Аэрацию питательной среды рекомендуется проводить путем подачи в нее стерильного воздуха в количестве 1-2 л/мин на 1 л среды.

Перемешивать питательную среду мешалкой целесообразно со скоростью 300-500 об./мин.

Завершают процесс выращивания клеток при достижении их содержания в культуральной жидкости не ниже 30·10⁹ кл./мл,

Лиофильную сушку рекомендуется проводить до содержания влаги в полученном препарате не выше 3%.

Емкость с высушенным препаратом предпочтительно заполнить азотом.

Достигается указанный технический результат также тем, что питательная среда для выращивания клеток Escherichia coli CR-322D, содержащая бульон Хоттингера, глюкозу, сульфат марганца, соль фосфорной кислоты и воду, дополнительно содержит дрожжевой экстракт, хлорид натрия, в качестве соли фосфорной кислоты – гидрофосфат калия, в качестве воды – воду водопроводную при следующем соотношении компонентов, мас.%:

бульон Хоттингера 18-23

глюкоза 0,35-0,45

дрожжевой экстракт 0,45-0,55

сульфат марганца 0,055-0,065

гидрофосфат калия 0,15-0,16

вода водопроводная остальное

Указанный технический результат достигается также тем, что бактериальный препарат для профилакгики и лечения желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственных и домашних животных и птиц характеризуется тем, что представляет собой лиофильно-высушенную биомассу клеток Escherichia coli CR-322D, полученную способом по п.1 формулы изобретения.

Указанный технический результат достигается также тем, что способ профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственных и домашних животных и птиц, включающий назначение им перорального приема клеток Escherichia coli CR-322D, имеет ту отличительную особенность, что клетки Escherichia coli CR-322D используют в виде бактериального препарата по п.9 формулы изобретения в дозе 0,25-42 условных единиц на прием, принимая за 1 условную единицу 1 млрд микробных клеток.

Указанный технический результат достигается также за счет того, что новорожденным телятам назначают прием клеток Escherichia coli CR-322D в первые 1,5-2,5 часа жизни, а затем на 4-5-е сутки жизни в дозе 38-42 условных единиц.

Телятам при заболевании назначают ежедневный прием клеток Escherichia cоli CR-322D 2 раза в сутки в дозе 38-42 условных единиц до клинического выздоровления.

Новорожденным поросятам назначают прием клеток Escherichia coli CR-322D в первые 4-6 час. жизни, затем на 6-7 дни жизни в дозе 5-7 условных единиц, а в возрасте 2-3 недели – в дозе 6-8 условных единиц.

Поросятам-отъемышам назначают прием клеток Escherichia coli CR-322D за 4-5 дней до отъема, в день отъема и через 4-5 дней после отъема в дозе 18-22 условных единиц.

Собакам при дисбактериозах назначают прием клеток Escherichia coli CR-322D в дозе 6-40 условных единиц 2 раза в день за 1,5-2,0 часа до приема корма.

Кошкам при дисбактериозах назначают прием клеток Escherichia coli CR-322D в дозе 3-5 условных единиц 2 раза в день.

Циплятам в 1-5 дни жизни назначают ежедневный прием клеток Escherichia coli CR-322D в дозе 0,25-0,35 условных единиц 2 раза в день, затем в 20-25 и в 40-45 дни жизни – по 1,8-2,2 условных единиц.

Собственные наблюдения показали, что выход клеток Escherichia coli CR-322D можно повысить, если в питательную среду для их выращивания ввести дрожжевой экстракт, изменить качественное и количественное соотношение входящих в ее состав солей, а глюкозу вводить в нее дозированно, по мере инкубации, что исключает подкисление среды и способствует интенсификации наращивания биомассы клеток.

Установлено, что выращивать клетки E.coli BKM CR-322D на новом составе питательной среды необходимо при постоянном перемешивании ее и аэрации, температура инкубации должна быть 30-31°С, а рН среды следует поддерживать в пределах 7,0-7,5 путем периодического добавления в нее 40%-ного водного раствора NaOH.

Сохранность жизнеспособных клеток E.coli BKM CR-322D, подвергнутых лиофильной сушке, можно повысить, если смешивать с защитной сахарозожелатиновой средой не клетки Е.coli BKM CR-322Д, отделенные от питательной среды, как в известном способе-прототипе [1], а содержащую их культуральную жидкость. Это позволяет обогатить состав лиофильно высушенного препарата биологически активными компонентами, сохранившимися в питательной среде после инкубации на ней клеток E.coli BKM CR-322D. Сохранность жизнеспособных клеток в препарате повышается также за счет его хранения в атмосфере азота.

Ниже приведены примеры реализации группы изобретений.

Пример 1.

Для приготовления препарата использовали штамм Escherichia coli М17(р74), полученный в Институте молекулярной генетики РАН [1], который был задепонирован под номером BKM CR-322D. Ампулу с лиофилизованной культурой E.coli BKM CR-322D вскрыли в асептических условиях, к содержимому ампулы добавили 1-2 мл мясопептонного бульона, полученную суспензию клеток высеяли во флаконы с мясопептонным бульоном и инкубировали при 30°С в течение 18 час.

Полученную культуру высеяли в пробирки со скошенным мясопептонным агаром с канамицином и инкубировали 18 час при 30°С. Выросшие клетки пересеяли в колбу со 100 мл мясопептонного бульона и инкубировали 7 час на качалке при 30°С. Полученную маточную культуру использовали для получения посевного материала. В бутыли с 2 л мясопептонного бульона засеяли маточную культуру в количестве 2% от объема питательной среды в колбе. Засеянные бутыли инкубировали при 30°С на качалке в течение 10-16 час. Выросшую культуру вносили в ферментатор в количестве 2,5% от объема содержащейся в нем питательной среды следующего состава, маc.%:

бульон Хоттингера 18

глюкоза 0,35

дрожжевой экстракт 0,45

MgSO₄ 0,055

К₂НРO₄ 0,15

NaCl 0,45

вода водопроводная остальное (до 100%).

Среда содержала 125 мг % аминного азота. Культуру инкубировали при температуре 30°С, при перемешивании мешалкой со скоростью 300 об/мин и при аэрации, осуществляемой путем подачи в питательную среду стерильного воздуха в количестве 1 л/мин на 1 л среды.

Глюкозу вводили в среду в виде 40%-ного раствора. Всего добавляли 1% от объема культуральной жидкости 40%-ного раствора стерильной глюкозы.

Через час после начала культивирования добавляли 0,05% глюкозы, через 3 часа – 0,1% глюкозы, через 4 часа – 0,1% (конечная концентрация), после 4-5 часов выращивания глюкозу добавляли до конечной концентрации от 0,8 до 1,2%.

В процессе культивирования рН среды поддерживали на уровне 7,0-7,5, периодически подавая в нее 40%-ный раствор NaOH. После 12 час. инкубации наблюдали прекращение роста популяции. Количество бактериальных клеток в полученной культуральной жидкости составляло 30·10⁹ бак.тел/мл по оптической плотности, измеряемой с помощью ФЭК. Для сравнения: при выращивании клеток E.coli ВКМ СК-322Д в соответствии со способом -прототипом [1] получали культуральную жидкость, содержащую 7-10·10⁹ бак.тел/мл.

По окончании процесса культивирования температуру культуральной жидкости снизили и поддерживали на уровне 16°С путем подачи в рубашку ферментатора оборотной воды с температурой 9-10°С.

Затем в ферментатор с охлажденной взвесью при работающей мешалке подали защитную сахарозожелатиновую среду, приготовленную следующим образом: с помощью 20%-ного раствора NaOH довели рН дистилированной воды до 7,0-7,1. Воду довели до кипения, добавили в нее 5% раствор желатина, с помощью 20%-ного раствора NaOH довели рН полученного раствора до 8,5 и прокипятили 15 мин. Затем к полученному раствору добавили 40% сахарозы. Полученный раствор содержал 5% желатина и 40% сахарозы. После фильтрования и стерилизации полученную сахарозожелатиновую среду использовали в качестве защитной среды. Культуральную жидкость и защитную среду смешивали в соотношении 3:1. После 15 мин перемешивания полученную смесь передали на стадию сублимационной (лиофильной) сушки.

Смесь разлили по 4-10 мл в стерильные флакончики емкостью 20 мл, подвергли замораживанию при -35°С в течение 20 час.

Лиофилизацию осуществляли в вакуум-сушильном аппарате, после герметизации которого из него откачали воздух до вакуума 5·10^-2 мм рт.ст.

Высушенная масса имела влажность 3%. По окончании высушивания отключили вакуумный насос и в аппарат через фильтры подали очищенный азот.

Перед укупоркой флаконы заполнили азотом, закрыли стерильными резиновыми пробками, которые затем зафиксировали металлическими колпачками.

Препарат представлял собой сухую пористую массу желтовато-белого цвета.

Пример 2.

По методике примера 1 получили биомассу клеток E.coli BKM CR-322D, которую ввели в питательную среду следующего состава, маc.%:

бульон Хоттингера 23

глюкоза 0,45

дрожжевой экстракт 0,55

MgSO₄ 0,065

К₂НРO₄ 0,16

NaCl 0,55

вода водопроводная остальное,

содержание аминного азота в среде – 155 мг %.

Инкубацию вели при температуре 31°С. В питательную среду дозированно подавали глюкозу в виде 40%-ного раствора (см. пример 1). Сосуд постоянно перемешивали мешалкой со скоростью 500 об/мин и постоянно вводили стерильный воздух в количестве 2 л/мин на 1 л среды. Процесс завершили через 10 час при содержании в культуральной жидкости 40·10⁹ бак.тел/мл.

Полученную культуральную жидкость (3 части) смешали с 1 частью защитной сахарозожелатиновой среды следующего состава, маc.%, так, чтобы конечная концентрация в сырье была:

сахароза 10,5

желатин 2

вода остальное (до 100%).

Влажность лиофильно высушенного препарата составляла 2,5%.

Пример 3. Для профилактики желудочно-кишечных заболеваний телят им с первой выпойкой молозива, но не позднее чем в первые 2 часа жизни, а затем на 4-е сутки жизни назначали по 40 условных единиц суспензии клеток Escherichia coli BKM CR-322D в виде бактериального препарата, приготовленного по методике примера 1. Случаев заболевания телят не наблюдалось.

Пример 4. При выявлении в хозяйстве случаев желудочно-кишечных заболеваний телят им назначали прием 2 раза в сутки по 40 условных единиц бактериального препарата, приготовленного в соответствии с примером 1. Лечение проводилось в течение 3 дней до полного клинического выздоровления. Случаев рецидива не выявлено.

Пример 5. Поросятам в первые 4-6 часов жизни и затем на 7-й день жизни выпаивали по 6 условных единиц бактериального препарата, приготовленного в соответствии с примером 1. Для профилактики отечной болезни поросятам-отъемышам скармливали по 20 условных единиц препарата, приготовленного по примеру 1, за 5 дней до отъема, в день отъема и через 5 дней после отъема – по 20 условных единиц. Случаи желудочно-кишечных заболеваний и отечной болезни поросят не выявлены.

Пример 6. Для профилактики желудочно-кишечных заболеваний цыплятам 1-5 дней жизни с кормом или с водой давали по 0,3 условных единицы бактериального препарата, приготовленного по примеру 1, ежедневно. Затем им давали по 2 условных единицы в периоды 20-25 дней жизни и 40-45 дней жизни. Желудочно-кишечных заболеваний не наблюдали.

Пример 7. Собакам при дисбактериозе выпаивали бактериальный препарат, приготовленный по примеру 1, – 2 раза в день за 1,5-2 часа до приема корма в количестве 6-40 условных единиц до полного клинического выздоровления (2-5 дней).

Пример 8. Кошкам при дисбактериозе выпаивали бактериальный препарат, приготовленный по примеру 1, – 2 раза в день за 1,5-2 часа до приема корма по 3-5 условных единиц до полного клинического выздоровления (2-5 дней).

Таким образом, группа изобретений позволяет повысить выход клеток E.coli BKM СR-322Д при их выращивании на питательной среде, приготовить лиофильно-высушенный бактериальный препарат, повысить его сохранность при хранении и повысить эффективность профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственных и домашних животных и птиц.

Формула изобретения

1. Способ получения бактериального препарата для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственных и домашних животных и птиц, предусматривающий выращивание клеток Escherichia coli CR-322D на питательной среде, содержащей бульон Хоттингера, глюкозу, сульфат марганца, соль фосфорной кислоты, воду при рН 7,0-7,5, смешивание полученной биомассы с сахарозожелатиновой средой и лиофильную сушку, отличающийся тем, что в состав питательной среды дополнительно вводят дрожжевой экстракт, хлорид натрия, в качестве соли фосфорной кислоты она содержит гидрофосфат калия, в качестве воды – воду водопроводную, глюкозу вводят дробно в процессе выращивания клеток, который ведут при температуре 30-31°С и сопровождают его стабилизацией уровня рН, постоянным перемешиванием и аэрацией, завершают процесс через 10-12 ч, а лиофильной сушке подвергают смесь полученной культуральной жидкости с сахарозожелатиновой средой в соотношении 3:1.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют сахарозожелатиновую среду, содержащую сахарозу, желатин и воду дистиллированную при их следующем соотношении, мас.%:

Сахароза 39-41

Желатин 5-6

Вода дистиллированная Остальное

3. Способ по любому из пп.1 и 2, отличающийся тем, что аэрацию питательной среды проводят путем подачи в нее стерильного воздуха в количестве 1-2 л/мин, на 1 л среды.

4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что перемешивают питательную среду мешалкой со скоростью 300-500 об./мин.

5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что завершают процесс выращивания клеток при достижении их содержания в культуральной жидкости не ниже 30·10⁹ кл./мл.

6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что лиофильную сушку проводят до содержания влаги в полученном препарате не выше 3%.

7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что емкость с высушенным препаратом заполняют азотом.

8. Питательная среда для выращивания клеток Escherichia coli CR-322D, содержащая бульон Хоттингера, глюкозу, сульфат марганца, соль фосфорной кислоты и воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит дрожжевой экстракт, хлорид натрия, в качестве соли фосфорной кислоты – гидрофосфат калия, в качестве воды – воду водопроводную при следующем соотношении компонентов, маc.%:

Бульон Хоттингера 18-23

Глюкоза 0,35-0,45

Дрожжевой экстракт 0,45-0,55

Сульфат марганца 0,055-0,065

Гидрофосфат калия 0,15-0,16

Вода водопроводная Остальное

9. Бактериальный препарат для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственных и домашних животных и птиц, характеризующийся тем, что представляет собой лиофильновысушенную биомассу клеток Escherichia coli CR-322D, полученную способом по п.1.

10. Способ профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственных и домашних животных и птиц, включающий назначение им перорального приема клеток Escherichia coli CR-322D, отличающийся тем, что клетки Escherichia coli CR-322D используют в виде бактериального препарата по п.9 в дозе 0,25-42 условных единиц на прием, принимая за 1 условную единицу 1 млрд. микробных клеток.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что новорожденным телятам назначают прием клеток Escherichia coli CR-322D в первые 1,5-2,5 ч жизни, а затем на 4-5-е сутки жизни в дозе 38-42 условных единиц.

12. Способ по п.10, отличающийся тем, что телятам при заболевании назначают ежедневный прием клеток Escherichia coli CR-322D 2 раза в сутки в дозе 38-42 условных единиц до клинического выздоровления.

13. Способ по п.10, отличающийся тем, что новорожденным поросятам назначают прием клеток Escherichia coli CR-322D в первые 4-6 ч жизни, затем на 6-7 дни жизни в дозе 5-7 условных единиц, а в возрасте 2-3 недели – в дозе 6-8 условных единиц.

14. Способ по п.10, отличающийся тем, что поросятам-отъемышам назначают прием клеток Escherichia coli CR-322D за 4-5 дней до отъема, в день отъема и через 4-5 дней после отъема в дозе 18-22 условных единиц.

15. Способ по п.10, отличающийся тем, что собакам при дисбактериозах назначают прием клеток Escherichia coli CR-322D в дозе 6-40 условных единиц 2 раза в день за 1,5-2,0 ч до приема корма.

16. Способ по п.10, отличающийся тем, что кошкам при дисбактериозах назначают прием клеток Escherichia coli CR-322D в дозе 3-5 условных единиц 2 раза в день.

17. Способ по п.10, отличающийся тем, что цыплятам в 1-5 дни жизни назначают ежедневный прием клеток Escherichia coli CR-322D в дозе 0,25-0,35 условных единиц 2 раза в день, затем в 20-25 и в 40-45 дни жизни – по 1,8-2,2 условных единиц.