Патент на изобретение №2244548

(54) СРЕДСТВО, ПОВЫШАЮЩЕЕ ИММУНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА СТОЛБНЯЧНОГО АНАТОКСИНА

(57) Реферат:

Предложено средство, повышающее иммуногенные свойства столбнячного анатоксина (адъювант). В качестве такого средства предложен растительный тритерпиноид – милиацин. Средство повышает величину иммунного ответа при применении в качестве вакцинального препарата столбнячного анатоксина. Стимулирующее влияние милиацина проявляется в ответ, как на первичное, так и на повторное введение вакцины, что позволяет сделать вывод о перспективности его применения при профилактических прививках столбнячным анатоксином. Учитывая высокую переносимость милиацина в широком диапазоне доз, предполагается возможным его практическое применение в качестве средства, способствующего повышению формирования вакцинального иммунитета при профилактических прививках столбнячным анатоксином. 6 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к эпидемиологии, и может найти применение при вакцинации.

В настоящее время в медицине широко применяются вещества, способные неспецифически стимулировать иммунный ответ при использовании вакцинальных препаратов. Такие вещества называются адъювантами.

К категории иммунологических адъювантов “обычно относят вещества, добавляемые к вакцинам с целью усиления иммунного ответа, с тем, чтобы добиться получения большего количества антител, снизить количество антигена, необходимого для иммунизации и сократить число инъекций антигена” (Иммунологические адъюванты. Доклад научной группы ВОЗ. Женева, 1978, с.7). Среди них – соединения алюминия (включая фосфат и гидроокись алюминия), эмульгированные водно-масляные адъюванты (смесь воды с минеральным маслом – неполный адъювант Фрейнда; смесь воды с арахисовым маслом).

Вместе с тем, даже применение адъювантов в ряде случаев не позволяет получить полноценный иммунный ответ и сформировать надежную защиту. Причиной этого могут быть различные обстоятельства, в том числе угнетение возможности иммунной системы полноценно реагировать на антигенные стимулы под воздействием факторов среды обитания (Беляев Е.Н, 1996). Такие токсические вещества, как оксид углерода, сероводород, сернистый газ, углеводороды обладают выраженным иммунодепрессивным действием (Горячев В.В., Доценко Ю.И., Парфенова Л.Ф., Мельникова И.К., 1988; Бойко В.И., 1990; Петров Р.В., Хаитов P.M., Орадовская И.В., Богова А.В., 1993). Токсиканты могут вызывать нарушение нормальных регуляторных механизмов и наследственных факторов, влияющих на созревание иммунной системы, системы метаболизма ксенобиотиков, что ведет к измененному постнатальному метаболизму и недостаточности иммунитета. Особенно чувствительны к такого рода неблагоприятным воздействиям дети, у которых сформировавшиеся нарушения могут сохраняться в скрытом состоянии вплоть до наступления половой зрелости (Roberts D.B., Chapman J.R., 1981).

Б.В.Каральник и С.Г.Маркова (1991) представили материалы, которые убедительно демонстрируют отрицательное влияние загрязнения среды на эффективность иммунизации АКДС-вакциной. АКДС-вакцина содержит столбнячный и дифтерийный анатоксины для создания иммунитета против столбняка и дифтерии, а также убитые коклюшные бактерии, используемые в качестве третьего вакцинального компонента для создания иммунитета против коклюша. Все компоненты вакцины адсорбированы на гидроокиси алюминия, являющегося ее (вакцины) адъювантом. Анализируя возможную связь между иммунологической эффективностью данной вакцины и загрязнением окружающей среды, авторы установили рост показателя незащищенности населения, т.е. недостаточный уровень иммунного ответа после вакцинации, в прямой зависимости от экологического неблагополучия. В частности, в Восточно-Казахстанской области, где доминирующими загрязнителями окружающей среды являются соединения полиметаллов, хлор, окислы азота и углерода, показатель незащищенности населения (по титру антител к дифтерийному анатоксину) в загрязненной зоне, по сравнению с чистой зоной, возрастал: у дошкольников с 11,8±1,6% до 22,0±1,2%; у школьников с 0,7±0,4% до 19,3±1,6%; у взрослых с 37,1±3,0% до 57,2±1,4%. Аналогичная направленность сдвигов отмечена и в отношении незащищенности населения от столбняка, определяемой по титру антител к столбнячному анатоксину (компоненту АКДС-вакцины). В Джамбульской области, где ведущими загрязнителями являются соединения фосфора и фтора, возрастание незащищенности у жителей загрязненной зоны по сравнению с чистой составило: у дошкольников с 0 до 3,8±1,1%; у школьников с 0,7±0,7% до 7,1±1,3%; у взрослых с 19,7±3,4 до 38,8±2,6%. Полученные данные показали расслоение под воздействием загрязнения среды человеческой популяции по интенсивности иммунного ответа на анатоксины.

В настоящее время к числу неспецифических веществ, способных повышать величину иммунного ответа относятся тритерпеноиды (тритерпены). Это – одна из групп химических веществ, относящихся к терпеноидным (или изопреноидным) соединениям. Последние представляют собой самый многочисленный класс низкомолекулярных соединений, молекулы которых построены из разветвленных C₅ единиц (М.Лукнер, 1979; Т.Гудвин, Э.Мерцер, 1986). Они объединяются в один класс по биогенетическому признаку, поскольку все эти соединения образуются из продукта восстановления 3-окси-3-метилглютаровой кислоты (мевалоновой кислоты). Большая часть известных к настоящему времени терпеноидов относится к веществам специализированного обмена растений, где они участвуют в процессах сигнализации, защиты от фитопатогенов и т.д. Многие антибиотики, фитоалексины, реппеленты имеют терпеноидную структуру (В.А.Пасешниченко, 1998). Среди терпеноидов выделяют соединения, относящиеся к монотерпенам (C₁₀P₁₆ ); сесквитерпенам (C₁₅H₂₄), дитерпенам (C₂₀H₃₂), тритерпенам (C_30,H ₄₈) (B.A. Пасешниченко, 1998). Последние, в настоящее время, являются объектом глубокого изучения, в связи с обнаруженными у них различными биологическими свойствами, используемыми в медицине.

Четкие сведения об иммунотропных свойствах тритерпеноидов были получены в исследованиях in vivo, характеризующих особенности формирования иммунного ответа в условиях их применения (S.Behboudi, В.Morein, В.Ronnberg, 1995). Экспериментально показано, что тритерпеноиды мыльного дерева проявляют выраженную адъювантную активность (В. Ronnberg et al., 1995). Исследуя эту активность к антигенному комплексу GP-340- рекомбинантного вируса Эпштейн-Барра, Е.Dotsika et al. (1997) установили, что не меняя характера иммунного ответа у мышей, тритерпеноиды способствовали усилению продукции специфических антител (Ig G₁ и Ig G₂ ) у животных, а также стимулировали антигеннеспецифическую пролиферацию лимфоцитов. Аналогичные результаты были получены при испытании этих же тритерпеноидов с оболочечным антигеном вируса гриппа на добровольцах, которым проводилась не только парентеральная, но и внутрислизистая вакцинация (В.Morein et аl., 1998). Включение в систему тритерпиноидов в качестве адъювантов позволило получить больший ответ при меньшей дозе антигена, а интраназальное использование, так же, как и через слизистую половых путей – стимулировало индукцию и секрецию Ig А. В качестве еще одного позитивного момента, связанного с применением такой вакцины, авторы называют отсутствие местной реакции слизистой в месте ее введения.

Новизной изобретения является выявленное свойство растительного тритерпиноида-милиацина, как иммуностимулятора при применении столбнячного анатоксина.

Существенным отличием является то, что при вакцинации столбнячным анатоксином применяют милиацин.

Предложенное средство 3--метокси-18-олеанен (милиацин) относится к группе природных циклических тритерпеноидов (см. химическую структуру ниже), содержится в просяном масле и представляет собой вещество белого цвета с температурой плавления 285-286°С. Он оптически активен, нерастворим в воде, слабо растворим в этиловом спирте, диэтиловом эфире, ацетоне, хорошо растворим в хлороформе. Милиацин обладает хорошей переносимостью в диапазоне доз от 2 до 1000 мг/кг. ЛД₅₀ этого соединения больше 1000 мг/кг (Л.Е.Олифсон с соавт., 1991), что свидетельствует об отсутствии у него токсических свойств.

Химическая структура пентациклического тритерпеноида – милиацина. 3--метокси-18-олеанен (милиацин)

Ранее нами было исследовано в эксперименте влияние милиацина на особенности формирования гуморального иммунного ответа мышей после их иммунизации эритроцитами барана (ЭБ) при разных схемах введения тритерпеноида (А.В.Кириллова, Т.В.Панфилова, Б.А.Фролов, 2000, 2002).

Эксперименты проводили согласно схеме, представленной в табл. 1. Всего было выполнено три экспериментальные серии, при этом каждая включала по три группы животных. Первую из них (опытную) составляли мыши, иммунизированные эритроцитами барана (5×10⁸) после предварительного внутрибрюшинного введения милиацина (2 мг/кг): десятикратно в течение 10 дней (серия I), трехкратно в течение трех дней (серия II) и трехкратно с интервалом между введениями в три дня (серия III). Соответствующими контролями к каждой опытной группе служили животные, иммунизированные эритроцитами барана после предварительного введения растворителя (контроль II) и мыши, иммунизированные ЭБ без предварительного введения

милиацина или растворителя (контроль I). Иммунизация животных (5×10⁸) во всех сериях осуществлялась на 11 сутки от начала эксперимента. Выраженность гуморального иммунного ответа оценивалась по показателям относительного и абсолютного содержания антителообразующих клеток (АТОК) в селезенке мышей (СВА×С ₅₇В1₆)F1 на 5-е сутки после иммунизации.

Данные о влиянии десятикратного введения милиацина на первичный иммунный ответ представлены в табл.2.

Как видно из таблицы, десятикратное введение растворителя (физ. раствор с твином-21 в конечной концентрации 1,6×10 ^-7 моль/кг (контроль II) не влияло на массу селезенки и содержание в ней спленоцитов по сравнению с мышами, иммунизированными ЭБ без какого-либо предварительного воздействия (контроль I). У животных этой группы отмечалось снижение (на 20,7%) относительного уровня АТОК/млн, следствием чего явилось уменьшение их суммарного содержания: АТОК/селезенку (на 21,2%) по сравнению с только иммунизированными мышами (контроль I).

Ведение милиацина (опыт) способствовало приросту массы селезенки и увеличению содержания в ней спленоцитов по сравнению с контрольными животными первой и второй групп. Причем по сравнению с животными первой группы (KI) эти отличия (соответственно, на 15,2% и на 19,3%) были статистически значимыми. Что касается способности к формированию АТОК у опытных мышей, то, как и у животных, получавших растворитель (КII) она была сниженной, по сравнению с иммунизированными мышами группы KI. Однако это снижение относительного числа АТОК, во-первых, носило менее выраженный характер (17,5% вместо 28,05%), а во-вторых, компенсировалось ростом суммарного количества спленоцитов. В итоге абсолютное содержание АТОК у животных опытной группы существенно не отличалось от показателя, регистрируемого у только иммунизированных животных (KI), a по сравнению с иммунизированными мышами, подвергавшимися воздействию растворителя, было выше на 26%.

Исследование последствий ежедневного введения милиацина на протяжении трех дней не обнаружило сколь либо значимого влияния тритерпеноида ни на массу селезенки, ни на количество спленоцитов в органе (табл.3).

Не установлено также и изменений в способности животных к формированию гуморального иммунного ответа. Относительное и абсолютное содержание АТОК у мышей опытной группы находилось в пределах значений, определяемых как у животных, подвергавшихся перед иммунизацией (по аналогичной схеме) воздействию растворителя (KII), так и у только примированных мышей (KI). Возможно, что отсутствие реакции иммунной системы на введение милиацина обусловлено особенностями постановки этой серии эксперимента, где имел место значительный временной промежуток (8 суток) между прекращением введения тритерпеноида и иммунизацией животных.

Иную картину представляла характеристика исследуемых показателей при трехкратном интервальном введении милиацина (табл.4).

Как следует из приведенных данных в этой экспериментальной серии, как и в обеих предыдущих, растворитель (КII) не влиял ни на массу селезенки, ни на количество спленоцитов. Его трехкратное интервальное введение не приводило и к нарушению формирования иммунного ответа: относительное и абсолютное содержание АТОК у мышей данной группы не отличалось от показателей, определяемых у животных, подвергнутых только иммунизации (КI).

В противоположность этому, введение милиацина (опыт) обусловливало увеличение массы селезенки и содержания в ней спленоцитов по сравнению как с животными, получавшими растворитель (KII), так и с мышами первой контрольной группы (KI). Обращает на себя внимание, что интенсивность этого прироста была даже более выраженной, чем в серии с десятикратным введением тритерпеноида. Так, если в последней прирост массы селезенки и количества спленоцитов по сравнению с интактными иммунизированными мышами (КI) составил, соответственно, 15,2% и 19,3%, то при трехкратном интервальном введении милиацина – 39,8% и 30,3%. Существенно, что увеличение количества клеток селезенки в данной серии, инициированное интервальным введением тритерпеноида, не сопровождалось угнетением формирования АТОК. А их относительное содержание у животных, получавших перед иммунизацией милиацин (306±24,6), даже несколько превосходило уровень, определяемый у мышей, иммунизированных без какого-либо предварительного воздействия (250±14,2). Следствием этих сдвигов, у животных опытной группы, явилось значительное возрастание абсолютного числа антителообразующих клеток. Прирост данного показателя, характеризующего суммарную мощность иммунного ответа по отношению к группам контрольных мышей (KI и KII), составил, соответственно, 39,9% и 37,1%. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при данной схеме использования тритерпеноида, он оказывает отчетливое стимулирующее влияние на гуморальный иммунный ответ, и что основу такой стимуляции составляет возрастание пула спленоцитов и усиление формирования АТОК.

Как показали последующие наблюдения (табл. 5), способность милиацина к усилению формирования антителообразующих клеток, наиболее отчетливо выявлялась при проведении аналогичной – серии экспериментов с использованием для иммунизации более низкой дозы эритроцитов барана (5×10⁷).

Как видно из таблицы, в этом случае, наряду с увеличением количества спленоцитов, у мышей опытной группы регистрировалось выраженное повышение относительного уровня АТОК, который превосходит аналогичные показатели как у только иммунизированных мышей (KI), так и у животных, иммунизированных на фоне предварительного введения растворителя (КII). В итоге происходил наиболее значимый прирост суммарного количества антителопродуцентов, составивший по отношению к KI и КII, соответственно 50,3% и 48,3%.

Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что влияние милиацина на гуморальный иммунный ответ зависит от схемы его применения и может сопровождаться отсутствием какого-либо эффекта (трехкратное ежедневное введение), угнетением формирования АТОК (десятикратное ежедневное введение) и стимуляцией иммунного ответа (трехкратное интервальное введение). Определяющими механизмами такой стимуляции являются возрастание суммарного пула спленоцитов и усиление формирования антителопродуцентов. Тот факт, что подобное усиление формирования АТОК зависит от величины антигенной нагрузки и наиболее выражено при использовании дозы ЭБ, составляющей 5×10⁷ , может быть связан с тем, что при этих условиях эксперимента неспецифическое влияние тритерпеноида на формирование антителопродуцентов не “перекрывалось” их специфической антигенной индукцией при более высокой дозе антигена.

Влияние милиацина на иммуногенные свойства столбнячного анатоксина

Описание эксперимента

Для иммунизации животных (мыши (CBA×C₅₇Bl ₆)F₁) использовался обогащенный столбнячный жидкий анатоксин (АС), сорбированный на гидроокиси алюминия Пермского производственного научного объединения БИОМЕД (серия 411-12, контрольный номер 445, срок годности до 08.2005).

В отличие от эритроцитов барана, являющихся корпускулярным антигеном, т.е. состоящим из взвешенных частичек, столбнячный анатоксин является растворимым антигеном. Во-вторых, эритроциты барана являются классическим антигеном в лабораторной практике при экспериментах на животных. Столбнячный анатоксин является классическим антигеном, применяющимся на людях. В-третьих, эритроциты барана служат для изучения иммунного ответа. Столбнячный анатоксин служит для создания вакцинального иммунитета, т.е. представляет собой профилактическое средство для предупреждения заболевания столбняком.

Животные иммунизировались подкожно в подлопаточную область передней конечности, однократно, в разовой дозе 0,5 мл, содержащей 10 ЕС столбнячного анатоксина.

Было использовано 2 группы животных:

I группа – контроль. Перед иммунизацией получали 3-х кратно, интервально растворитель (твин-21) в дозе 1,6·10^-7 моль/кг массы животного.

II группа – опыт. Перед иммунизацией получали 3-х кратно, интервально милиацин в дозе 2 мг/кг массы животных.

Иммунизация анатоксином выполнялась на 11 сутки от начала эксперимента.

Забой животных обеих групп осуществлялся через 14 и 28 дней после иммунизации.

Для оценки влияния милиацина на формирование вторичного иммунного ответа часть мышей опытной и контрольной групп на 28 сутки после первичной иммунизации повторно подвергали иммунизации столбнячным анатоксином в той же дозе. Оценка ответа на повторную иммунизацию у этих животных проводилась спустя 14 суток.

Количество животных для оценки иммунного ответа при первичной иммунизации на каждом сроке в опытной и контрольной группе составляло по 15 мышей. При повторной иммунизации – по 20 мышей. Животных забивали декапитацией и осуществляли забор крови с последующим получением сыворотки.

Оценка иммунного ответа проводилась путем определения титра антител микрометодом РНГА с использованием диагностикума эритроцитарного столбнячного антигенного жидкого (комплект №1). Предприятие-изготовитель: АООТ “Биомед” им. И.М.Мечникова (активность 1:1280; серия 73; дата изготовления 12.02).

Полученные результаты представлены в табл.6, отражающей средние значения десятичных логарифмов титров антител, выявляемых в контрольной (получавших растворитель) и опытной (получавших милиацин) группах животных в различные сроки после первичной иммунизации (14 и 28 день) и на 14 сутки после повторной иммунизации.

Как следует из представленных данных, иммунизация мышей столбнячным анатоксином на фоне предварительного введения милиацина, обеспечивала формирование более выраженного иммунного ответа, по сравнению с контрольными животными, иммунизированными столбнячным анатоксином после предварительного введения растворителя. Эти различия начинали проявляться уже на 14 сутки после иммунизации и достигали значимости (достоверности) к 28 суткам. При этом существенно, что если у контрольных животных к указанному сроку регистрировалась тенденция к снижению количества антител, то у животных опытной группы отмечался их прирост.

Повторная иммунизация мышей (вторичный иммунный ответ) сопровождалась наиболее высоким приростом уровня антител в сыворотке крови у животных, как опытной, так и контрольной групп. Однако обращает на себя внимание, что у животных опытной группы он достигал более высоких значений чем в контроле.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что 3-х кратное, интервальное (через 3 дня) введение милиацина обусловливает более интенсивный иммунный ответ при иммунизации животных столбнячным анатоксином. Это стимулирующее влияние милиацина проявляется в ответ, как на первичное, так и на повторное введение вакцины, что позволяет сделать вывод о перспективности его применения при профилактических прививках столбнячным анатоксином.

Исходя из изложенного, учитывая высокую переносимость милиацина (Л.Е.Олифсон с соавт., 1991) в широком диапазоне доз, предполагается возможным его практическое применение в качестве средства, способствующего повышению формирования вакцинального иммунитета при профилактических прививках столбнячным анатоксином.

УКАЗАТЕЛЬ ЛИТЕРАТУРЫ

2. Беляев Е.Н. Роль санитарно-эпидемиологической службы в обеспечении санитарно-эпидемического благополучия населения РФ. Москва. Издательский информационный центр госкомитета санэпиднадзора РФ. – 1996. – 416с.

4. Гудвин Т., Мерцер Э. Введение в биохимию растений. М.: Мир, 1986. – Т.2. – С.42-106.

5. Иммунологические адъюванты. Доклад Научной группы ВОЗ, Женева, 1978. – С.5-25.

6. Каральник Б.В., Маркова С.Г. Экологические аспекты АКДС-вакцинации. – ЖМЭИ. – 1991. – №12. – С.34-38.

9. Лукнер М. Вторичный обмен у микроорганизмов, растений и животных. М.: Мир, 1979. – С.194-252.

13. Петров Р.В., Хаитов Р.М., Орадовская И.В., Богова А.В. Региональные проблемы здоровья населения России. Под ред. акад. В.Д. Белякова.- М.: ВИНИТИ, 1993. – С.175-185.

Формула изобретения

Применение милиацина в качестве средства, повышающего иммунногенные свойства столбнячного анатоксина.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 18.07.2005

Извещение опубликовано: 27.12.2006 БИ: 36/2006