Патент на изобретение №2152617
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ И ХАРАКТЕРА ВОСПАЛЕНИЯ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ
(57) Реферат: Способ может быть использован в медицине, а именно в пульмонологии. У больного получают бронхоальвеолярный лаваж, в котором определяют биологические маркеры. В качестве биологического маркера используют метаболиты оксида азота и при увеличении их концентрации в период обострения болезни более чем в два раза по сравнению с контролем судят об активности воспаления, а показатели ниже контрольных значений в два и более раза в период ремиссии указывают на необратимый характер воспаления дыхательных путей. Способ позволяет наиболее точно мониторировать течение болезни, оптимизировать лечебные программы, обладает высокой чувствительностью и предполагает уменьшение затрат на лечение вследствие максимальной оптимизации терапии. 3 табл. Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии. В современной концепции хронические обструктивные болезни легких рассматривают с позиций хронического воспалительного процесса дыхательных путей, который эволюционирует независимо от степени тяжести и проявлений хронического обструктивного бронхита и бронхиальной астмы [6]. В то же время характер морфологических проявлений воспаления при этих заболеваниях различен, как и подходы к лечению. К настоящему времени признается актуальной разработка биологических маркеров, позволяющих проводить дифференциальную диагностику как внутри гетерогенной группы болезней, объединенных понятием ХОБЛ, так и позволяющих прогнозировать течение процессов воспаления и обструкции дыхательных путей и оптимизировать проводимую терапию [8,9]. Используемые в практической медицине методы оценки активности воспалительного процесса основаны на данных клинического анализа и ряда биохимических показателей крови, изменение которых мало специфично и недостаточно информативно при обострении хронической обструктивной болезни легких. В то же время оптимальной средой, позволяющей наиболее точно отразить состояние дыхательных путей признается жидкость бронхоальвеолярного лаважа. Существуют способы оценки активности воспаления дыхательных путей с помощью исследования содержания индолалкиламинов (серотонина и гистамина) в жидкости бронхоальвеолярного лаважа [1, 10]. Однако изменение их при хронических обструктивных болезнях легких происходит независимо от характера воспаления и не имеет существенных различий при хроническом обструктивном бронхите и бронхиальной астме. В последнее время в литературе обсуждается вопрос о возможности использования свободного радикального газа оксида азота (NO) в качестве одного из маркеров активности и характера воспаления в дыхательных путях [9]. Измерение содержания газа в выдыхаемом воздухе является простым, неинвазивным, но дорогостоящим методом диагностики. Принимая во внимание вышесказанное, целью настоящего изобретения явилась разработка способа оценки активности воспаления в дыхательных путях, определяя метаболиты NO в жидкости бронхоальвеолярного лаважа у больных бронхиальной астмой и хроническим обструктивным бронхитом. Способ осуществлялся следующим образом. Всего было обследовано 105 больных обоего пола в возрасте 20-60 лет, из них у 70 человек имел место хронический обструктивный бронхит и у 35 бронхиальная астма. Диагноз хронического обструктивного бронхита устанавливали согласно эпидемиологическим критериям ВОЗ и международному консенсусу по диагностике и лечению хронических обструктивных болезней легких [4, 6] , а бронхиальной астмы – в соответствии с международным консенсусом по бронхиальной астме [2]. У всех больных хроническим обструктивным бронхитом и бронхиальной астмой наблюдалось среднетяжелое течение болезни. Состояние функции внешнего дыхания оценивали с помощью показателей, отражающих бронхиальную проходимость – объем форсированного выдоха за 1 с, максимальную объемную скорость выдоха на уровне 25%, 50%, 75% форсированной жизненной емкости легких. Субсегментарный бронхоальвеолярный лаваж получали в объеме 25 мл по методике, описанной Г.И. Лукомским и соавт. [3]. Контролем служил бронхоальвеолярный лаваж, взятый у здоровых лиц. Аликвоту жидкости бронхоальвеолярного лаважа, содержащую в своем составе 10 частей 2% ЭДТА центрифугировали, исследования проводили с бесклеточными фракциями бронхоальвеолярного лаважа. В жидкости бронхоальвеолярного лаважа больных бронхиальной астмой и хроническим обструктивным бронхитом определяли сумму метаболитов оксида азота – NO2– и NO3–. Так как NO2– является неустойчивым анионом и при воздействии окислителей легко доокисляется до NO3–, для определения всей суммы метаболитов нитрат ион восстанавливали с помощью металлического кадмия, импрегнированного медью до нитрит иона, содержание которого определяли с помощью реактива Грейса [7]. Измерение проводили на спектрофотометре Dynatech при 540 нм (С1.99, Т1.99). В норме уровень метаболитов NO в жидкости бронхоальвеолярного лаважа был равен 0,83 + 0,04 нмоль/мл. Для сравнения специфичности используемого маркера в жидкости бронхоальвеолярного лаважа также изучена активность индолалкиламинов – гистамина и серотонина. Анализ индолалкиламинов (гистамина и серотонина) был проведен одномоментно в одной пробе, что позволило установить более тесную связь между ними, путем создания одинаковых условий. Определение концентрации гистамина проводили в присутствии ортафталиевого диальдегида (Sigma, США). Измеряли интенсивность флюоресценции при 440 нм полученного комплекса моноамина и ортафталиевого диальдегида при длине волны возбуждения 338 нм методом двойного сканирования. При построении калибровочной кривой использовали стандарт основания гистамина (Fluka Chemical AG, Германия). Количественный анализ серотонина в жидкости бронхоальвеолярного лаважа проводили по стандартной методике [5] в кислотной фазе на спектрофлюориметре при длине волны возбуждения 295 нм и регистрировали при 545 нм методом двойного сканирования. Количество гистамина и серотонина в контрольной группе обследованных составило соответственно 0,007  0,0002 и 0,085 0,001 мкмоль/л.
Результаты обрабатывали методом вариационной статистики, достоверность различий определяли по критерию Стьюдента (t) и непараметрическим критериям рангов Спирмена. Данные считались достоверными при Р < 0,05.
Как видно из данных, представленных в таблице 1, в период обострения бронхиальной астмы и хронического обструктивного бронхита наблюдалось повышение уровня NO с наиболее высокими значениями при бронхиальной астме, когда его показатели превысили содержание у здоровых почти в три раза, а в сравнении с больными хроническим обструктивным бронхитом вдвое.
К периоду ремиссии секреция NO и соответственно содержание продуктов его метаболизма в жидкости бронхоальвеолярного лаважа снижались. При этом у больных бронхиальной астмой концентрация метаболитов NO оставалась достоверно выше, чем у здоровых. Тогда как при хроническом обструктивном бронхите секреция газа резко падала и становилась почти вдвое ниже по сравнению с контрольной группой обследованных.
Для решения вопроса о возможной взаимосвязи между активностью NO и процессами обструкции дыхательных путей, связанных с преобладанием обратимого и необратимого характера воспаления при бронхиальной астме в первом случае и хроническом обструктивном бронхите во втором, проведен корреляционный анализ непараметрических рангов Спирмена показателей функции внешнего дыхания и концентрации NO2– и NO3– в жидкости бронхоальвеолярного лаважа.
Установлено, что в период обострения хронического обструктивного бронхита и бронхиальной астмы между рассматриваемыми показателями существуют тесные обратные связи, о чем свидетельствуют данные коэффициента корреляции r = -0,55, Р < 0,001 и r = -0,63, Р < 0,001 соответственно. К периоду ремиссии бронхиальной астмы прослеженная закономерность сохраняется (r = -0,48, Р < 0,001), тогда как при хроническом обструктивном бронхите корреляционная взаимосвязь ослабевает и становится недостоверной (r = -0,13, Р > 0,05). Иначе, повышение активности NO при бронхиальной астме совпадает с ухудшением показателей бронхиальной проходимости. Тогда как при ХОБ увеличение концентрации метаболитов NO в ЖБАЛ происходит только в период обострения болезни при наличии активного воспаления в дыхательных путях, а к периоду ремиссии, несмотря на сохранение бронхиальной обструкции вследствие необратимого воспалительного процесса в дыхательных путях уровень секреции газа снижен.
Таким образом, проведенные исследования показали, что содержание метаболитов NO в ЖБАЛ при БА и ХОБ зависит от активности воспалительного процесса и повышается при обострении заболеваний, наиболее заметно в первом случае и зависит от характера воспаления, сохраняясь повышенным при ремиссии БА и резко снижаясь в этот же период у больных ХОБ при преобладании необратимых изменений в бронхиальном дереве.
Как видно из данных, представленных в таблице 2, в период обострения бронхиальной астмы и хронического обструктивного бронхита наблюдалось значительное повышение концентрации гистамина. К периоду ремиссии заболеваний уровень моноамина снижался, но оставался выше, чем у здоровых.
Проведенный анализ непараметрических рангов Спирмена между показателями гистамина и объемом форсированного выдоха за 1 секунду в разные периоды болезни показал наличие тесных отрицательных связей. Так, во время обострения хронического обструктивного бронхита и бронхиальной астмы показатели коэффициента корреляции составили -0,68 (Р < 0,001) и -0,78 (Р < 0,001) соответственно. Во время ремиссии прослеженная закономерность сохранялась, и показатели коэффициента составили при хроническом обструктивном бронхите r = -0,59 (Р < 0,001) и бронхиальной астме r = -0,62 (Р < 0,001).
Таким образом, активность гистамина в жидкости бронхоальвеолярного лаважа больных хронической обструктивной болезнью легких, в отличие от оксида азота, развивается однонаправленно и связана как с активностью воспаления, так и со степенью обструктивных нарушений, повышаясь при обострении бронхиальной астмы и хронического обструктивного бронхита и снижаясь к периоду ремиссии. Иначе говоря, содержание гистамина в жидкости бронхоальвеолярного лаважа не зависит от характера воспаления дыхательных путей при различных формах хронической обструктивной болезни легких.
Как следует из данных, представленных в таблице 3, динамика уровня серотонина в жидкости бронхоальвеолярного лаважа при хроническом обструктивном бронхите и бронхиальной астме была аналогичной содержанию гистамина. Так, при обострении хронической обструктивной болезни легких активность моноамина значительно возрастала и, снижаясь к периоду ремиссии, оставалась выше, чем в контрольной группе.
Анализ непараметрических критериев ранга Спирмена показал наличие умеренных отрицательных корреляционных связей между содержанием серотонина и вентиляционными параметрами функции внешнего дыхания при обострении бронхиальной астмы (r = -0,62, Р < 0,01) и хронического обструктивного бронхита (r = -0,63, Р < 0,01), с сохранением установленной закономерности к периоду ремиссии.
Таким образом, динамика содержания серотонина в жидкости бронхоальвеолярного лаважа больных хронической обструктивной болезнью легких аналогична изменению уровня гистамина и связана как с активностью воспаления в дыхательных путях, так и с обусловленными воспалением обструктивными нарушениями независимо от обратимости или необратимости их характера.
Итак, проведенное нами биохимическое тестирование жидкости бронхоальвеолярного лаважа больных хроническим обструктивным бронхитом и бронхиальной астмой показало существование взаимосвязи между содержанием в изучаемой биологической среде метаболитов NO, гистамина, серотонина и активностью воспаления при хронической обструктивной болезни легких.
При этом динамика уровня индолалкиламинов при бронхиальной астме и хроническом обструктивном бронхите связана с активностью воспаления и не зависит от его характера, развиваясь однонаправленно при преобладании как обратимого, так и необратимого компонентов.
В то время как при изучаемых формах хронической обструктивной болезни легких в содержании метаболитов NO имеются существенные различия, а именно уровень секреции газа в период обострения бронхиальной астмы более чем вдвое превышает показатели у здоровых и выше, чем у больных хроническим обструктивным бронхитом. В период ремиссии хронического обструктивного бронхита в условиях необратимого ремоделирования стенки бронхов активность оксида азота резко снижается.
Тогда как при бронхиальной астме при наличии обратимых воспалительных изменений показатели метаболитов оксида азота в жидкости бронхоальвеолярного лаважа остаются выше, чем у здоровых.
Таким образом, предлагаемый нами способ оценки активности и характера воспалительного процесса в дыхательных путях позволяет проводить дифференциальную диагностику между двумя ведущими формами хронической обструктивной болезни легких – бронхиальной астмой и хроническим обструктивным бронхитом, наиболее точно мониторировать течение болезни и оптимизировать используемые лечебные программы. Экономический эффект предлагаемого способа диагностики основан на возможности оценки активности NO в жидкостных средах без использования дорогостоящей хемолюминесцентной техники. Высокая чувствительность метода предполагает уменьшение затрат на лечение вследствие максимальной оптимизации терапии.
Список литературы
3. Лукомский Г. И., Шулутко М.В., Виннер М.Г. Бронхопульмонология. М.: Медицина. – 1982. – 400 с.
7. Green L.C., Wagner D.A., Glogowski J. et al. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N] Nitrate in biological fluids. /Analyt. Biochemistry.- 1982. -Vol. 126. – P. 131-138.
Формула изобретения
РИСУНКИ
|
||||||||||||||||||||||||||
